出典
クラス2 CRISPRヌクレアーゼの標的切断の分子機構
  • クラス1とクラス2の対比;クラス2タイプⅡのCas9とクラス2タイプVのCas12a/Cpf1およびCas12b/C2c1について分子機構を比較対照し (サイズ、トランス活性化RNAの必要性、PAM配列、シード配列の長さ、二本鎖DNA切断の特徴およびスペーサの長さの対照表あり)、クラス2タイプⅥのRNAガイドRNA切断活性を帯びたCas13a/C2c2とCas13b/C2c6にも言及
クラス2CRISPRヌクレアーゼのオフターゲット抑制 - sgRNAとCas9の改変またはタイプVの利用
  • sgRNA活性の長さと配列を構成する塩基の調節;eSpCas9, Cas9-HF1, HypaCas9, デュアルnCas9, dCas9-FokI;AsCas12aとLbCas12aではほとんどオフターゲット編集が見られなず、Cas12bもin vitroではオフターゲット編集検出されず
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  • CRISPRメモ_2018/04/18 - 2. CRISPR/Cas9による二本鎖DNA切断修復にあたり、誤りが多いNHEJに対して精密な編集を可能とするHDRの比率を高める法
Cas9-sgRNA複合体RNPのin vivo活性調節によるオフターゲット抑制
  • [不活性状態から活性化] agRNA (aptazyme)を埋め込んだsgRNA)をsgRNAに融合し、aptazymeの自己開裂を誘導する低分子でsgRNAの活性を調節;sgRNAまたはラパマイシンにより分割しておいたCas9 (split Cas9)を二量体化;インテイン結合やリジンのケージ化で不活性化したCas9をそれぞれインテイン開裂低分子と紫外光照射で活性化;菌類由来の光受容体VVD (Vivid)から作出されたMagnetsドメイン (pMagとnMag)を二分割したCas9のN末端側とC末端側に結合しておくことで、青色光によりCas9を一体化ひいては活性化 (活性調節可逆的)
  • [活性状態から不活性化] 編集標的遺伝子用sgRNAとcas遺伝子を標的とするsgRNAの併用;抗CRISPRタンパク質のデリバリー;Cas9にエストロゲン受容体αを組込み、リガンドでCas9活性をアロステリックに調節 (arCas9);Cas9にエストロゲン受容体ERT2を融合し、リガンドでCas9を細胞質から核へ移行 (iCas9);Cas9にジヒドロ葉酸レダクターゼ (DHFR)を融合しトリメトプリムによりCas9分解 (Degron Cas9);Magnetsドメインと青色光によるCas9の二量体化 (活性調節可逆的)
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ゲノム編集の多重化
  • 多重sgRNAの生成:Csy4が認識・切断する配列を介してsgRNAを多重化;標的細胞内在のRNアーゼの標的となるtRNAを介したsgRNAを多重化
  • Cas12aの場合は、内在するcrRNA前駆体からcrRNAガイドを生成する触媒ドメインを活用
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ゲノム編集システムのデリバリー
  • 臨床応用には、高い編集効率に加えて、細胞毒性を最小限にとどめかつ遺伝子改変完了後速やかに消滅するデリバリー法が必要であるが、まだ実現していない。
  • AAV、エレクトロポレーション、ポリマー/脂質/DNA/金のいずれかのナノ粒子、iTOP (induced transduction by osmocytosis and propanebetaine)の各手法について、デリバリーの適用範囲 (in vitro/ex vivo/in vivo)、デリバー対象 (ssDNA/DNA/RNA/RNP)、存在期間 (数時間〜数年)および長所短所の一覧
CRISPRに誘導されるDNA切断の修復機構
  • 非相同末端結合 (NHEJ):典型的NHEJ (C-NHEJ)、DNA末端のマイクロホモロジーに依存する代替的NHEJ (Alt-EJ)
  • ドナーDNAの利用:相同アームを融合したドナーDNAを利用する相同組換え修復;ssODNを利用する一本鎖アニーリング (single-strand annealing: SSA)または合成依存的単鎖対合(synthesis dependent single-strand annealing model: SDSA)
  • CRIS-PITCh法HITI法 
1塩基編集
将来展望
  • 臨床応用には精度、効率およびデリバリーの更なる向上が必要であるが、CRISPR革命は続く。