1. CRISPRiによるヒト遺伝子間相互作用 (genetic interactions:GIs)の大規模マップの構築と解析

出典 "Mapping the Genetic Landscape of Human Cells" Horlbeck MA [..] Weissman JS,
　　 Gilbert LA. Cell 2018 Jul 19.

手法
  • UCSFのL. A. GilbertとJ. S. Weissmanの研究チームは今回、472遺伝子の組み合わせ222,784遺伝子ペアを標的とする1,044,484種類の二重sgRNAを帯びたレンチウイルスベクターのライブラリーを構築し、Jurkatヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株とK562ヒト慢性骨髄性白血病細胞株において、CRISPRi(dCas9-KRAB)でサイレンシングした遺伝子ペアの関係性を細胞増殖の観点から定量化することで、大規模なヒトCRISPRi GIマップを構築した。
  • 対象とした遺伝子は、研究チームが先行研究にてCRISPRiで細胞増殖・生存に必須と判定した遺伝子であり、転写、翻訳をはじめとする多様な細胞過程をカバーし、また、必須性以外の機能は不明確な遺伝子も含まれている。
  • 遺伝子ペアに対応する２種類のsgRNAsを帯びたレンチウイルスベクターには、４種類の長さ16bpのランダム配列をバーコードとして組み込んでおき、２種類のsgRNAsに加えてバーコードもシーケンシングすることで('triple sequencing'と命名)、二重sgRNAs間の組み換えを検出し解析から排除した。
  • K562とJurkatの双方で細胞増殖に影響を与えた遺伝子ペアを元に構築したGIマップは、111,628種類の２遺伝子間相互作用で構成されるに至った。
大規模なGIマップがもたらす効果
  • GIシグナチャーに基づき機能的に相関する遺伝子のクラスタを同定することで、機能が不明または不明確な遺伝子の機能推定が可能になる（例 TMEM261を電子伝達系の新奇コンポーネントとして同定）
  • 広範な細胞過程にわたるパスウエイとタンパク質複合体における既知および新奇GIsの同定・発見が可能になる。
  • ヒト疾患治療の標的となり得る遺伝子ペアそしてまたはパスウエイ間の緩衝関係(buffering)や合成不全・致死(synthetic sick/lethal:SSL)関係を、両者の間に直接的な物理的接触がない場合でも、発見可能になる
  • 論文では、コレステロール生合成経路とDNA修復経路との連関を発見、研究チームはその分子機序を「コレステロール合成関連遺伝子Fdpsの不活性化→中間代謝物(イソペンテニル二リン酸:IPP)蓄積→デオキシリボヌクレオチドdNTPの欠乏→複製DNA損傷→細胞のDNA修復過程(DNA修復遺伝子HUS1)への依存性が高まる」とした。注目すべきことに、Fdpsは抗コレステロール薬・骨粗鬆症薬ビスホスホネートの標的である。
CRISPRi関連論文
CRISPRi関連crisp_bio記事一覧："CRISPRi site:crisp-bio.blog.jp"でWeb検索

変異体解析関連crisp_bio記事：2-18-04-22 酵母三重変異体の解析から初めて見えてきたこと

2.CRISPR-bind: CRISRP/dCas9により、'Bionano genome mapping'に組み込み可能な配列特異的ラベリングを実現
  • [出典]"CRISPR-bind: a simple, custom CRISPR/dCas9-mediated labeling of genomic DNA for mapping in nanochannel arrays" Zhang D, Chan S, Sugerman K, Lee J, Lam ET, Bocklandt S, Cao H, Hastie AR (Bionano Genomics). bioRxiv 2018 Jul 19.
  • Bionano Genomicsが商品化したBionano genome mappingでは、1 Mbレベルの長さのDNAをマイクロチャネルとナノチャネルを経て直線状へと伸長し、塩基特異的に蛍光標識後、画像の計算機処理などを経て、配列を決定する。Bionano Genomicsの研究チームはこれまでのニック・トランスレーションによるDNAの標識 (Nick-Label-Repair Stain: NLR)などの標識法に加えて今回、dCas9により、任意の配列に特異的な標識を１段階で可能とするCRISPR-bindを開発した。
  • 目的に応じたcrRNAと蛍光色素で標識したtracrRNAで形成したgRNAとdCas9との複合体RNPによって、バクテリア人工染色体(BAC) DNA (DUF1220)およびMbオーダーのヒトゲノムDNA (Alu)のラベリングを実現した。
Bionano genome mapping利用論文例
3. DNAリガーゼIVのホモログDnl4pを削除すると、Komagataella phaffiiにおける相同組み換えによる遺伝子ターゲッティング効率が向上する
  • [出典]"Deletion of DNA ligase IV homolog confers higher gene targeting efficiency on homologous recombination in Komagataella phaffii" Ito Y, Watanabe T, Aikawa S, Nishi T, Nishiyama T, Nakamura Y, Hasunuma T, Okubo Y, Ishii J, Kondo A. FEMS Yeast Res 2018 Jul 11.
  • K. phaffi (旧名 Pichia pastoris)は、組み換えタンパク質発現のホストとしてよく利用されているが、NHEJ活性が高いため、遺伝子ターゲッティングの効率が比較的低い。神戸大と(株)カネカの研究チームは、遺伝子ターゲット効率がDnl4p欠損により向上し、Ku70pとの二重欠損によりさらに向上することを見出した。
4. [レビュー]多機能ナノ粒子によるウイルスに依存しない遺伝子治療の現状・課題・可能性
  • [出典]"Non-viral gene therapy using multifunctional nanoparticles: Status, challenges, and opportunities" Lin G [..] Yong KT. Coord Chem Rev 2018 Jul 14.
  • ナノ粒子の応用例の一つとしてCRISPR/Cas9システムの送達にも言及
5. [レビュー]CRISPR技術の進歩と３Dゲノム
  • [出典]"The advances in CRISPR technology and 3D genome" Wang W, Zhang L, Wang X, Zeng Y. Semin Cell Dev Biol 2018 Jul 9.
  • CRISPR/Cas9システムの分類と特徴、多機能性、臨床応用の可能性に加えて、CRISPR/Cas9技術によるCTCF結合サイトの入れ換えまたは削除によるゲノム３次元構造解析研究を紹介