[出典] "GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology" Wierson WA [..] Essner JJ. bioRxiv. 2018 Oct 3.

概要
  • Iowa State U., U. Utah School of Medicine, U. Utah Medical Center, Temple U., Mayo ClinicならびにU. Minnesotaの共同研究グループが、標的DNAとドナーDNAの双方を切断することで、HEMJ (homology-mediated end joining)と称されるマイクロホモロジー媒介末端結合(Microhomology-mediated end joining, MMEJ)/一本鎖アニーリング(single-strand annealing, SSA)を介したDSB修復過程による外来配列ノックインを実現するGeneWeldを開発した。
具体的な手法(原論文Figure 1から引用した下図参照)
GeneWeld
  • 切断には、ドナーとゲノムの双方をCas9で、または、ドナーをCas9でゲノムをTALENで、の二つの方法を使用した。ゲノム切断のCas9は、標的部位を認識するsgRNAで誘導した (上図 a-中段を参照)。
  • ドナーは、標的部位に挿入するカーゴを、ゲノムの標的部位に対応する一対の24または48塩基の相同アームで挟む作りで、pGTag (plasmids for Gene Tagging)と命名した(上図 a-下段を参照)。ドナーの切断には、ゲノム上に特定の標的配列が存在しないユニバーサルgRNA (UgRNA)を設計・利用した。
  • GeneWeldとpGTagにより、ゼブラフィッシュ胚、ブタ線維芽細胞、ヒト K-562細胞にて、効率がこれまでの10倍に向上し、ゼブラフィッシュにおいて生殖細胞を介した伝達率が~50%に達した。
  • pGTagと相同アーム設計支援WebサイトGTagHD http://www.genesculpt.org/gtaghd/
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