1. Perturb-seqのバージョンアップ
[注] 本項紹介bioRxiv 投稿のNature Biotechnology誌査読付き論文版については、2020年4月6日付の以下のcrisp_bio記事を参照:2020-04-06 Perturb-seqバージョンアップ:スケーラブルかつマルチに
[出典] "Direct capture of CRISPR guides enables scalable, multiplexed, and multi-omic Perturb-seq" Replogle JM [..] Weissman JS, Adamson B. bioRxiv. 2018-12-21.

背景
  • Perturb-seqは、バーコードを付したプール型gRNAライブラリーに基づくCRISPR-ko/iスクリーンにより選別した細胞をscRNA-seqすることで遺伝子機能を同定する手法の一種である (Wikipedia引用下図参照;Perturb-seq
    crisp_bio記事 CRISPRメモ_2018/02/05 - 1. CRISPR/Cas9遺伝子編集結果を単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)で読み出す手法一覧 )参照
 Perturb-seqベクターの構成 (Cell 2016論文 Figure 1より引用)
   "U6::sgRNA::EF-1α::Puromycin::T2A::BFP::Guide BarCode (GBC)::polyA";
   sgRNAと対になったポリアデニル (polyA)化したGBCを共発現

 これまでのscRNAseqに基づく遺伝子発現プロファイルを読み出しとする
 CRISPRスクリーン (Perturb-seqとCROP-seq)の限界

  • sgRNA-GBCライブラリーをレンチウイルスで細胞に導入する際に、sgRNAGBCが分離するリスクを伴うためアレイ型ライブラリーが望ましく、プール型への展開が困難 (スケーラビリティーに限界)
  • この問題をベクター設計で解決したCROP-seqではCRISPR-ko/iの組み合わせ解析が困難
“direct capture Perturb-seq”を開発
  • scRNA-seqにおいて、ドロップレット反応に必要なバーコード付きオリゴ-dTプライマーと共に、標的に特異的なバーコード付きRTプライマーを利用することで、これまでのGBCの3'末端領域の配列決定に加えて、sgRNAの3’末端領域と5'末端領域の配列決定を可能にすることで実現;Perturb-seqの可用性、拡張可能性および適応性を格段に向上させた。
関連資料
  • J. S. Weissmanの解説ビデオ (1 h:8 m:34 s): Perturb-seq: High Throughput CRISPR Screening Via Single-Cell RNA Sequencing. 2017-05-10 Nature Webinar.
  • Perturb-seq応用例: CRISPR関連文献メモ_2016/12/19 - 1. Perturb-seq: プール型遺伝子スクリーンのスケーラブルなscRNA-seqプロファイリングによる分子回路分析法;2- Perturb-seqによって、小胞体ストレス応答(Unfolded Protein Response, UPR)を分析 (100種類のCRISPR-ko/i (perturbation);perturbationあたり500 scRNA-seq;50,000単一細胞ライブラリー構築に1日シーケンシングに2日、データ解析・解釈に半年)
2. CRISPR-Cas9ガイドin silico設計法ベンチマーク
[出典] "A benchmark of computational CRISPR-Cas9 guide design methods" Bradford J, Perrin D. bioRxiv. 2018-12-20. > PLoS Comput Biol. 2019-08-29
  • 17種類の設計法 (Table 1引用下図参照)を、予測したガイドの性能とともに、計算処理の性能の観点からも比較評価:マウス19番染色体全長の解析が比較的短時間可能であったのはCasFinder, CRISPR-ERA、mm10dbおよびCRISPR-DOの4種類 (GuideScanは可能であったが7時間弱を要した);sgRNAScore2、CHOPCHOP, mm10db、CRISPR-DOおよびWU-CRISPRがガイドの効率をもっとも明快に提示したが、互いに整合するガイドは限られていた。gRNA
  • CRISPR-Cas9ガイドの設計ツールはまだまだ改良の必要があり、特に、計算処理の最適化とメタ解析 (種々の設計手法の複合化)が必要である。