(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 20160420)
  1. [論文] 内在性遺伝子を強力に転写活性化片山翔太近藤 亨 (北海道大学)
    • CRISPR/Cas9による切断とマイクロホモロジー媒介末端結合(microhomology-mediated end joining, MMEJ)を利用してメチル化プロモーターを非メチル化プロモーターに置換することによって、内在性遺伝子の効率的活性化と細胞運命の制御を実現。
    • HEK293T細胞にて、神経細胞とオリゴデンドロサイト細胞分化を制御する転写因子のOLIG2 遺伝子の発現を実現(効率 18.2%)。
    • ヒト多能性胎生期癌細胞株NTERA-2においても、CRISPR/Cas9-MMEJによってOLIG2 発現を実現し、NTERA-2の分化を誘導することを見出した:OLIG2 発現によって、ニューロン・マーカーのβⅢチューブリン発現(効率〜20%)とニューロフィラメント160(効率〜10%)発現が誘導された。
    • また、HEK293T細胞とNTERA-2細胞におけるNANOG の発現活性化(効率〜18.2%)も実現。
    • HEK293T細胞では、コンストラクト導入後21日、NTERA-2細胞ではコンストラクト導入後7日にOLIG2 発現;PCR判定ではオフターゲット作用は非検出。
  2. [論文] Cas9D19Aニッカーゼを利用した遺伝子型と表現型のスクリーニングによるゲノム編集の高性能化: Stephen P. Jackson (Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Inst., University of Cambridge)
    • All-in-One Cas9D19Aベクターによるゲノム編集、FACSによる濃縮、続く、遺伝子型と表現型のハイスループット・スクリーニングの実験手法を確立し、高効率かつ最小限のオフターゲット作用での同質遺伝子ノックアウトとノックインを実現した。
    • All-in-One Cas9D19A:U6/センス鎖sgRNA/U6/アンチセンス鎖sgRNA/Cas9D19A/2A/EGFPのオールインワン・ベクターが効果的。
    • HEK293T細胞におけるVEGFA 遺伝子を標的とする予備実験とRPE-1細胞におけるタンパク質RIF-1を標的とする予備実験によって実験手法を検証。
    • 3種類のヒト細胞株(HEK293T; U2OSHAP1)において、DNA損傷応答(DNA-damage response, DDR)タンパク質のMDC153BP1RIF1およびP53、加えて、核膜を構成するタンパク質Lamin A/Cを標的として実証実験。
    • 一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを相同テンプレートとして両アレル(biallelic)ノックイン・クローンを効率的に生成することで、RIF1 遺伝子座へのEcoRI 認識サイト導入とヒストンH2AFX 遺伝子座への点変異導入を実現し、DNA二本鎖切断サイトにおけるDDR因子の集合を阻害。
    • MDC1 と53BP のダブルノックアウトを実現し、Nutlin-3に対する耐性機構も解明
  3. [論文] CRISPR/Cas9によるラットの軟骨肉腫のHAS2ノックアウトは、ヒアルロン酸(Hyaluronan, HA)が
    アグリカン(aggrecan)維持に必須であることを示唆:Warren Knudson (East Carolina University)
    • ヒアルロン酸分解酵素やHAオリゴ糖に代えてHA合成酵素(Has2)を標的とするCRISPR/Cas9によって、2種類のラット軟骨肉腫(rat chondrosarcoma, RCS)細胞株からHas2 ノックアウト(KO)・クローンを作出。
    • Has2 KOクローンでは、ヒアルロン酸合成または細胞外マトリックスが見られず。Has1 とHas3 発現の補償も見られず。
    • Ad-Has2 の形質導入により、Has2 KO RCSにおけるアグリカン回復。
  4. [特許] CRISPR/Cas9ゲノム編集による筋ジストロフィーの予防:Eric N. Olson (UT Southwestern)
  5. [論文] プロスタグランジンF2αによるカワスズメ(cichlid) メスの生殖行動制御の神経基盤:Scott A. Juntti 
    (Stanford University)
    • CRISPR/Cas9を利用してカワスズメ(Astatotilapia burtoni )における標的遺伝子変異導入を初めて実現し、Ptgfr を欠損したカワスズメのメスは生殖行動を示さないことを見出した。