[出典] "sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing" Graf R, Li X, Chu VT, Rajewsky K. Cell Rep. 2019-01-29.

Max Delbrück Center for Molecular MedicineとBerlin Institute of Healthの研究チームの報告
  • これまでに報告されたsgRNA活性のデータセットから、非効率なsgRNAにTT-およびGCC-モチーフがほぼ特異的に存在することを同定した。
  • これらのモチーフは、標的配列の3'末端でPAM近位4塩基に対合する20塩基sgRNAの17-20塩基内に位置する。
  • Lamin B1遺伝子座をモデルとして、CDSの3'末端に、モチーフを帯びた、または帯びていないsgRNA標的配列とGFP配列をノックインし、CRISPR/Cas9によるノックアウト実験を行い、モチーフがノックアウト効率を一桁下げることを確認した。
  • 2種類のモチーフが遺伝子編集の効率を下げる分子機構の解明も試み、TT-モチーフを帯びたsgRNAsはウイルスベクターからの発現が非効率なことを介してノックアウト効率低下をもたらし、GCC-モチーフを帯びたsgRNAsはin vivoで標的部位へのアクセスが阻害されることを介してノックアウト効率低下をもたらすことを示唆する結果を得た。
  • TT-モチーフの問題は、ウイルスベクターによらないデリバリーと発現法を選択するか、RNAスキャフォールドに変異 (スキャフォールド5'末端における4つのTうち5番目または2番目と3番目をAに変換)を導入することで回避可能である。