[出典] "CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors" Liu JJ, Orlova N, Oakes BL [..] Nogales E, Doudna JA. Nature. 2019-02-04; RESEARCH HIGHLIGHT ""CasX: a new and small CRISPR gene-editing protein" Yang H, Patel DJ. Cell Res. 2019-04-16.

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概要
  • J. D. DoudnaらUC Berkeleyの研究グループは2016年に、メタゲノム解析からCRISPRシステムのエフェクタとして小型のCasX (Cas12e)を発見し、配列解析から他のCRISPR-Casエフェクエターとは、Cas9またはCas12aとRuvCヌクレアーゼドメインを共有するだけで、しかもその配列同一性は16%未満であり、また、進化系統解析からも、CasXは他のCRISPR-Casエフェクターと一線を画する構造と分子機構を備えていることを示唆していた。
  • UC Berkeleyなどの研究グループは今回、CasX の活性と構造基盤をNatureオンラン版にて報告し、CasXは、「小型、独特のDNA切断機序、および、非病原性微生物由来と、他のCRISPR/Casシステムに無い特長を備えている」とした。
詳細
  • CasX遺伝子座は、RuvCドメインを含む長さ986-aaのcasXエフェクター、 cas4、cas1、cas2、tracrRNAおよびCRISPRアレイで構成されている。
  • CasXは、PAM配列 TTCNに隣接するgRNA20塩基セグメントに相補的な二本鎖DNA (dsDNA)の領域において、gRNAの非標的鎖と標的鎖をPAMからそれぞれ12-14 ntと22-25 ntの部位で切断 (DSB)し、10 ntの長さのオーバーハングを伴う付着末端 (staggered end)を生成する。これは、Cas12aとCas12bと同様の現象であるが、Cas12aやCas12bに見られるDNA結合に伴うssDNAの非選択的トランス切断活性は最小限であった。
  • E. coliにおいて、 Deltaproteobacteria由来CasX (DpbCasX)がDSBを介して細胞生存性を低下させ、CasXの活性部位の3つのアミノ酸をアラニンに変換して不活性化したdCasXをもとにしたCRISPRiにより遺伝子発現を抑制可能なことを実証した。
  • また、HEK293T細胞において、Planctomycetes由来CasX (PlmCasX)がDpbCasXより高い活性を示し、編集効率はSpyCas9の30-55%に達することを見出した。
  • クライオ電顕法により再構成したCasX、CasX-sgRNAの二者複合体およびCasx-sgRNA-DNAの三者複合体の、計8種類の構造 (以下の"構造データ"一覧参照)から、CasXが他のCRISPR-Casタンパク質に類したドメインを帯びていることを同定すると共に、新奇なドメインを同定した。
  • Cas9-sgRNAの二者複合体において、その質量にgRNAが占める割合が他のタイプⅡまたはVのCRISPR-Casでの8-20%に比べて26%と大きく、また、CasX単体の分解能が20Åにとどまったことから、 RNAがCasXに独特のコンフォメーションをもたらしているとした。
  • さらに、構造データに加えて系統解析と生化学的解析から、CasXがCas9とCas12aに類しているが明確に異なるドメインと、新奇なRNAとタンパク質の折りたたみ構造を帯びていることが明らかにした。また、DNAの巻き戻しとDSB生成の分子機序にも考察を加えた。
Cas9のDBS分子機序モデル
  1. CasXは、gRNA結合によって安定な構造をとり、標的探索を開始する。
  2. 今回同定したNTSB (non-target-strand binding)ドメインが関与して、DNAの巻き戻し、R-ループ形成およびgRNAの非標的鎖のRuvCドメインの活性部位への誘導が進行する。
  3. 今回新たに同定したZnフィンガーを含むTSL (target-strand binding)ドメインが関与して、RNA-DNAハイブリッドが折れ曲り標的鎖を切断へと誘導する。
構造データ
  1. EMDB 8987 ApoCasX (20Å分解能)
  2. EMDB 8988 CasX-gRNA binary complex (7.5Å分解能)
  3. EMDB 8980/ PDB 6E5O CasX-gRNA-DNA(30bp) State I (3.7Å分解能)
  4. EMDB 8994/PDB 6E7A  CasX-gRNA-DNA (30bp) State II (4.2Å分解能)
  5. EMDB 8996/PDB 6E79  CasX-gRNA-DNA(45bp) State I (3.2Å分解能)
  6. EMDB 8991 CasX-gRNA-DNA (45T-45NT) State II (5.2Å分解能)
  7. EMDB 8989 CasX-gRNA-DNA (45T-20NT) State I (4.5Å分解能)
  8. EMDB 8990 CasX-gRNA-DNA (45T-20NT) State II (4.4Å分解能)