2023-06-26 RGEN-ISL (別名 CRISPR-FISH) のプロトコル論文の書誌情報を以下に追記PROTOCOL "CRISPR-FISH: A CRISPR/Cas9-Based In Situ Labeling Method" Potlapalli BP, Ishii T, Nagaki K, Somasundaram S, Houben A.  In: Heitkam T, Garcia S. (eds) Plant Cytogenetics and Cytogenomics. MIMB 2023-06-20. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3226-0_20 [著者所属] Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, 鳥取大学, 岡山大学

2019-03-13
 New Phytologist 刊行論文に準拠した初稿
[出典] "RNA‐guided endonuclease – in situ labelling (RGEN‐ISL): a fast CRISPR/Cas9‐based method to label genomic sequences in various species" Ishii T [..] Houben A. New Phytologist. 2019-03-08.
  • Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Researchなドイツ研究グループの報告 (筆頭著者は現鳥取大学)
  • Alt-R CRISPR-Cas9システムに則り、trancrRNAを蛍光色素で標識したtracrRNA-ATTO 550/Alexa Fluor 488とcrRNAとの融合gRNAを、SpyCas9と融合した複合体 (RNP)として送達することで、in situでのDNAラベリングを実現し、RGEN-ISL (RNA‐guided endonuclease – in situ labelling)と命名した (原論文 Figure 1 引用下図参照) 。2019-03-13 9.07.53
  • RGEN-ISLはFISHと異なりdsDNA変性を必要とせず、ひいてはクロマチン構造を損なうことがない。また、多重化や免疫組織染色との併用が容易であり、4~37°C温度範囲で利用可能であり、エフェクターとして、Cas9、dCas9, Cs9nおよび標識したCas9の利用が可能である。
  • 実証実験:ベンサミアナタバコのテロメア反復配列可視化および蛍光標識タンパク質との同時可視化 (原論文Figure 4引用下図内左図参照);シロイヌナズナ、モロコシおよびヒト細胞のセントロメの反復配列可視化 (原論文Figure 6引用下図内右図参照);シロイヌナズナでのセントロメアとヒストン (CENH3)の同時可視化;反復配列の可視化には単一のgRANで十分であったが、その他の領域の可視化には多重gRNAの利用が必要 (今後の課題)2019-03-13 9.08.31