1. オフターゲットDNAを標的とするsgRNAの切断活性をデュアルルシフェラーゼアッセイ法で判定する
  • [出典] "Target DNA mutagenesis-based fluorescence assessment of off-target activity of the CRISPR-Cas9 system" Wang D, Liu C, Han J, Ma D, Xi Z. RSC Adv. 2019-03-19.
  • 南開大学の研究グループがデュアルルシフェラーゼアッセイ法に準拠して生細胞内でオフターゲットサイトにおけるCas9の活性を直接検出する手法を開発;ルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンの上流領域に、sgRNAに対するオンターゲットDNAまたは種々のミスマッチを帯びたオフターゲットDNAを挿入し、オフターゲットに対応するルシフェラーゼ活性測定 (原論文Fig. 1/2引用下図参照)OFF TARGET
2. Cas13bによる標的RNAの認識・切断の分子機構モデルを構築
[出典] "High-Resolution Structure of Cas13b and Biochemical Characterization of RNA Targeting and Cleavage" Slaymaker IM [..] Zhang F. Cell Rep. 2019-03-26;構造情報 PDB 6DTD High-resolution crystal structure of Cas13b from Prevotella buccae (1.65 Å 分解能)
  • Feng Zhangらは今回、Prevotella buccae由来Cas13b (PbuCas13b)とcrRNAの複合体構造をX線結晶構造解析により1.65 Å 分解能で決定し、生化学的実験による安定性、動態および機能解析を経て、Cas13bが標的RNAを認識する分子機構のモデルを提案した (原論文Figure 5から引用した下図参照)Cas13b
  • Cas13サブタイプ (Cas13a-d)の中で解析が進んでいるCas13a, b, dはいずれもリボヌクレアーゼ活性を帯び標的認識後に非選択的にRNAを切断するが、構造上の共通性は少ない。特に、Cas13bの構造と機構が、Cas13aおよびCas13dと明確に異なることが明らかになった。
  • Cas13bのモデルに基づいてCas13bの特異性を改変することで、Cas13bを利用した応用技術 (A-to-I塩基置換法REPAIR*; 核酸検出・診断法SHERLOCK**)の適応範囲拡大の可能性を示した
  • (*) crisp_bio 2017-10-26 D. R. LiuのDNA1塩基編集法”ABE”とF. ZhangのRNA1塩基編集法”REPAIR”
  • (**) crisp_bio 2018-02-28 CRISPRによる核酸検出・診断(DETECTRとSHERLOCK)[SHERLOCKv2 論文] 
3. [レビュー] CRISPR-Casシステムの起源と進化
[出典] REVIEW "Origins and evolution of CRISPR-Cas systems" Koonin EV, Makarova KS. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019 May 13;374(1772):20180087.
  • KooninとMakarovaによる最新レビュー:CRISPR-Casシステムは、スペーサー獲得のadaptationのモジュールと、標的DNAを探索切断するエフェクターのモジュールが、少なくとも部分的には互いに独立に進化;前者は、トランスポゾンの一種であるcasposonsとスペーサ獲得を担うCas1タンパク質ホモログに由来;クラス1とクラス2のCRISPR-Casシステム(Figure 1引用下図参照)Koonin & Makarova
    をそれぞれ特徴づけるマルチタンパク質のエフェクター複合体と単一タンパク質のエフェクター複合体について、その起源と進化を詳細に考察 
  • 本レビューは、Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences誌のDiscussion meeting issue ‘The ecology and evolution of prokaryotic #CRISPR-Cas adaptive immune systems’ 収録のレビューと論文のべ16編の一つ (Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 25 March 2019. Volume 374, Issue 1772
4. 非カチオン性ナノ粒子で、Hisタグで標識したCreリコンビナーゼとCRISPR/Cas9 RNPのデリバリーを実現
[出典] "Intracellular Delivery of His-Tagged Genome-Editing Proteins Enabled by Nitrilotriacetic Acid-Containing Lipidoid Nanoparticles" Li Y, Li AC, Xu Q. Adv Healthc Mater. 2019 Mar;8(6):e1800996. Published online 2018-11-22.
  • ニトリロ三酢酸を含むlipidoidナノ粒子により、Hisタグで標識したゲノム編集タンパク質の細胞内デリバリを実現