(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/12/19

 プール型CRISPRゲノム編集技術シングルセルRNA-seqscRNA-seq技術を組合わせたスクリーンをテーマとする3報が、Cell 1215日号に掲載された:本記事掲載の 1.[論文] 2.[論文]が、Broad InstituteRegevらとUCSFWiessmanらによる共同研究の成果Perturb-seq3.[論文]Weizmann InstituteAmitらによるCRISP-seq法の報告;4.[論文]は、10月にプレプリント・レポシトリーであるbioRxiv に投稿された同一概念のCRISPR Drop-seq法の研究報告。

[関連crisp_bio記事]

  1. Perturb-seq: プール型遺伝子スクリーンのスケーラブルなscRNA-seqプロファイリングによる分子回路分析法
    • Atray Dixit et al. “Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens.” Cell. 2016 Dec 15;167(7):1853-1866.e17.
    • Corresponding author: Aviv Regev (Broad Institute/MIT)
    • 遺伝子スクリーンは哺乳類細胞における遺伝子機能解析のツールとして有用であるが、これまで、大規模な転写プロファイルのような複雑な表現型のアッセイを実現するには至らなかった。共同研究チームは今回、scRNA-seqと、 細胞に“perturbations”を与えるプール型CRISPRゲノム編集を組み合わせたPerturb-Seq法を開発した。
      • Perturb-seqのベクターはsgRNAに対応するバーコード配列guide barcode (GBC)を含む構成(U6-sgRNA-Ef1a-puromycin-T2A-BFP-GBC-PolyA)とし、細胞のバーコード(unique cell barcode; CBC)と分子のバーコード(a unique molecular identifier; UMI)を併用することで、sgRNAのプールとscRNA-seqの突き合わせを実現。
      • 概念実証実験として、ポリ多糖類に対する樹状細胞の応答を調節する転写因子に注目して、免疫細胞と細胞株を対象として200,000細胞を解析した。
      • Perturb-seqによって、個々の“perturbations”が遺伝子標的、遺伝子サイン(遺伝子発現パターンの特徴)、および細胞状態に与える影響の同定を実現した。
      • さらに、免疫が活性化する際に、調節因子群が分化、抗ウイルス応答およびミトコンドリアにおよぼす新たな作用の推定が可能になった。
    • Perturb-Seq法における“perturbations”を与えるCRISPRゲノム編集法としてCRISPRiCRISPRaといった種々のバリエーションを採用することが可能であり、また、今回利用したscRNA-seq技術をDrop-seq技術などの他の手法に差しかえることも可能である。
  1. Perturb-seqによって、小胞体ストレス応答(Unfolded Protein Response, UPR)を分析
  1. CRISP-seqプール型CRISPRスクリーン技術とscRNA-seqを組合わせて免疫回路を分析
    • Diego Adhemar Jaitin et al. “Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR- Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.” Cell. 2016 Dec 15;167(7):1883-1896.e15.
    • Corresponding author: Ido Amit (Weizmann Inst.)
    • 多重並列なscRNA-seqとプール型CRISPRスクリーンを組合わせたCRISP-seq法を開発し、同一細胞内での遺伝子“perturbations”とトランスクリプトームのプロファイリングによって、多重な転写因子の機能とそれらの相互作用を同時に解明することが可能なことを示した。
      • CRISP-seqに拠って自然免疫の調節回路の解析を試みた。発生と免疫応答の鍵となる制御因子を標的とする“perturbations”を加えた数万の細胞の解析から、骨髄系細胞の分化と病原体に対する応答を調節する制御ネットワークにおける制御因子の相互作用と冗長性を明らかにした。
  1. CROP-seq: シングルセル・トランスクリプトームをリード・アウトとするプール型CRISPRスクリーニング
    • Datlinger P, Rendeiro AF, Schmidl Schmidl  [..] Bock C. “Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome read-out.” bioRxiv. Posted online 2016 Oct 27. > Nat Methods 2017-01-18.
    • Corresponding author: Christoph Bock (CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences/Medical U. Vienna/MPI Informatics)
    • プール型gRNAを利用するCRISPRゲノム編集技術とDrop-seq技術を融合したCRISPR Drop-seq (CROP-seq)法を開発。CROP-seq法は、scRNA-seq実験において個々のgRNAsを検出可能にするgRNAベクター、scRNA-seqによるハイスループット・アッセイ、シングルセル・トランスクリプトームをgRNAsに対応づけるデータ処理パイプライン、および、gRNAに誘導される転写プロファイルの解析・解釈を可能にするバイオインフォマティクスで構成されている。このCROP-seq法によって、プール型CRISPR技術と複雑なシグナル伝達パスウエイの分析が可能になる。
    • 概念実証は、Jurkat細胞においてT細胞受容体(TCR)の活性化の解析実験によって達成した。