2017年05月

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2017/01/05

  • Corresponding authors: 鈴木未来子山本雅之(東北大学)
  • [背景]
    • KEPA1-NRF2システムは、酸化ストレスと生体異物ストレスに対する細胞の防御システムを調節する。NRF2は転写因子であり、抗酸化、解毒および代謝に関わる酵素やトランスポーターをコードする細胞保護遺伝子の発現を活性化する。ストレスのない状態では、KEAP1がNRF2タンパク質を分解することでNRF2の活性を抑制し、ストレスを受けた状態でKEAP1によるNRF2分解促進が停止し、短時間で蓄積するNRF2が標的遺伝子の転写を活性化する。
    • 様々な癌細胞で、KEAP1を介したNRF2分解の機構が不全となりNRF2が恒常的に蓄積される現象が起きている。このNRF2の蓄積は、癌細胞の増殖を利し、また癌細胞に抗癌剤と放射線療法に対する耐性をもたらす。
  • 研究チームは今回、NRF2集積による癌細胞の化学療法と放射線療法に対する耐性を抑制することを目的として、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングによってNRF2阻害剤を探索し、その結果、ハロフジノン(halofuginone)誘導体を同定した。
    • ハロフジノンの低毒性の誘導体を低量処方することでNRF2のタンパク質レベルが低減した。すなわち、ハロフジノンが細胞内のアミノ酸飢餓応答を誘導することで、全体的なタンパク質の合成を抑制し急速にNRF2を欠損させた。
    • ハロフジノンの処方によって、NRF2依存癌細胞の抗癌剤耐性がin vitro でもin vivo でも減弱した。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2017/01/04

  1. [RESEARCH HIGHLIGHT] ゲノム編集活性のオフ・スイッチ
  2. [論文] Escherichia coli のCas1-Cas2インテグラーゼとプロトスペーサーおよびアクセプターDNAの三者複合体形成機構
    • Corresponding author: Pierre Plateau (Université Paris-Saclay)
    • ゲルシフトアッセイ(electrophoretic mobility shift assays (EMSAs))を利用して、Cas1-Cas2とプロトスペーサーおよびアクセプターとなるプラスミドDNAとの間の複合体形成を、in vitro で追跡し、CRISPR遺伝子座を有しスーパーコイル状のアクセプターDNAの場合に、長時間安定な三者複合体が形成されることを見出した。
    • Cas1-Cas2のアクセプターDNAへの結合は、プロトスペーサーの存在によって亢進されるが、安定な複合体形成には、プロトスペーサーが、5塩基より長い3’末端一本鎖オーバーハングを持たないことが条件であった。
    • CRISPR遺伝子座への変異導入実験から、CRISPR遺伝子座に隣接するリーダー配列の存在の如何によらず、リピートのパリンドロミック・モチーフが1つ存在すれば、安定な三者複合体が形成されることが明らかになった。
  3. [論文] CRISPR/Cas9によるPAF53ノックアウト実験はPAF53が哺乳類細胞の生存に必須であることを示唆した
    • Corresponding author: Lawrence I. Rothblum (U. Oklahoma College of Medicine)
    • 栄養そしてまたは成長因子の欠乏下の哺乳類細胞では本質的にrDNAの転写が停止するが、1996年にPAF53が特定のrDNA転写に必須であり、PAF53のレベルが成長因子に制御されることが報告されていた(Hanada et al., 1996)。脊椎動物PAF53の酵母ホモログA49は、酵母の生存には必須ではないが“最適な増殖に必須”であると報告された(Wang et al., 2015)。研究チームは今回、PAF53が細胞生存に必須か否かを確定することを目的として、CRISPR/Cas9技術による遺伝子産物のノックアウト実験を行った。
      • ヒト293細胞においてPAF53の第2エクソンを標的とするsgRNAによるノックアウトを試みた。また、FLAG標識したマウスPAF53をコードしたプラスミドをCRIPR/Cas9システムと同時に感染させてその効果を見た。
      • ヒトのPAF53を発現しない細胞は、マウスPAF53の異所性発現が存在しない場合に限られていた。すなわち、細胞は、リコンビネーションまたはオルターナティブリーディングフレームを介した独特の機構によってPF53を発現し、PAF53が細胞生存に必須であることを示唆した。
  4. [論文] CRISPR/Cas9システムによって、分裂終了細胞におけるシナプトブレビン/シナプス小胞結合膜タンパク質(synaptobrevin/VAMP)機能を阻害
    • Corresponding author: Lisa M. Monteggia (U. Texas Southwestern Medical Center, )
    • Synaptobrevin 2(Syb2/VAMP2)を標的とするCRISPR/Cas9レンチウイルスを初代培養海馬ニューロンに感染させることで、Syb2タンパク質と免疫組織化学的染色を劇的に低減し、Syb2が多くの終末ボタン(boutons)で検出されなくなり、また、編集された初代培養海馬ニューロンがSyb2がノックアウトされたニューロンの表現型を再現することを見出した。
    • CRISPR/Cas9を高効率なレンチウイルスで感染させることで、ニューロンの大部分でSyb2をノックアウト可能であり、この手法は、分裂終了後ニューロンにおける細胞非自律的シナプス前の表現型の解析ツールと成り得る。
  5. [特許] Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding CRISPR related proteins and synthetic sgRNAs and methods of use.
    • 発明者:Hoge, Stephen (Cambridge, MA, US); Yi-chun, Eric (Cambridge, MA, US); Chakraborty, Tirtha (Cambridge, MA, US)
    • 譲受人:Moderna Therapeutics, Inc. (Cambridge, MA, US)

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2017/01/04

  • Last author: 浦野泰照(東京大学)
  • β-ガラクシダーゼと発色基質X-galを代表とする酵素/基質の組合せからなるレポーターシステムが広く利用されているが、それぞれに一長一短があり、既存のシステムと直交するレポーターシステムがまだまだ必要とされている。
    • 大腸菌由来のアゾ還元酵素AZoRは、酸素正常状態(normoxia)でもアゾ化合物におけるアゾ結合(N=N)43850001
      を還元・開裂する。研究チームは先行研究(Piao, W. et al., 2013)で、生細胞内において低酸素状態でアゾ結合の還元・開裂によって強い緑色蛍光(2-methyl rhodamine green(2-Me RG))を発生する無蛍光性(non-fluorescent)の化合物を合成していた。
    • 研究チームは今回、AzoRの蛍光発生基質候補として、rhodamine(ローダミン)のアゾベンゼン部分を置換するazo rhodamine誘導体のライブラリーを設計・合成した。
    • 合成したazo rhodamineはいずれも無蛍光性であった。フェムト秒分解能の吸収分光によって、光による励起状態の継続時間は5 ps未満であり、cis 異性体が形成されなかったことから、この無蛍光性は、N=N結合をめぐる超高速のコンフォメーション変化(例 ツイスト)によることが示唆された。
    • 電子供与基を含むazo rhodamineは、AzoRによって強い緑色蛍光(2-Me RG)を発生したが、一方で、電子求引性基を含む誘導体には蛍光増が見られなかった。この機構は、電子供与基を含むazo rhodamineにおいては、N=Nが、AroRによってヒドラジンに還元され、さらに続く非酵素的反応によって開裂されるためであることも明らかになった。
    • HeLa細胞において、AzoR/azo-rhodamineレポーターシステムによって、アゾ還元酵素を発現している生細胞が可能なことを、一細胞の分解能で実証した。


(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2017/01/03

  • Corresponding authors: Jared E. ToettcherClifford P. Brangwynne (Princeton U.)
  • 細胞内には、リボ核タンパク質(RNP)ボディー(body)、核小体、PMLボディーなど、膜に囲まれていない(membrane-less)が空間的に明確に区分されている細胞内小器官が多数存在する。こうした液体状顆粒構造体は、天然変性タンパク質領域(intrinsically disordered protein regions (IDRs))を介した相転移によって形成されるというのが共通認識になってきた。
  • プリンストン大学の研究チームは今回、光励起によって生細胞内でIDRを介した相転移を制御可能とする光遺伝学プラットフォーム“optoDroplet”システムを開発した。種々のRNA結合タンパク質のIDRにmCherry蛍光タンパク質とArabidopsis thaliana の光回復酵素相同領域(photolyase homology region (PHR))Cry2を結合したコンストラクトを構築し、光のオン・オフに対する反応を生細胞内で観察した。
  • NIH 3T3細胞において、mCherryでラベルしたCry2 PHRは青色光によってほとんどクラスターを形成しなかったが、FUSのN末端IDR、ALSに関連したRNA結合タンパク質HNRNPA1のCマッタンIDRあるいはDDX4のN末端IDRとCry2 PHRのコンストラクトはすべて、ほとんどの細胞において急速にクラスターを形成した。
  • コンストラクトは臨界濃度を超えた状態で、光によって相分離を起こし、時空間的に明確な液体状optoDropletsを形成し(liquid-liquid phase separation)、FUS optoDropletの形成は活性化サイクルを繰り返しても、可逆的であった。
  • 一方で、高濃度な状態で高強度の光を照射すると不可逆的な固体状凝集体を形成するに至った。
  • OptoDropletは、細胞内相転移と細胞生理および疾患との関連の解明に貢献するツールである。










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