2017年07月

[]Leptotrichia shahii由来Cas13acrRNA/標的RNAとの二者/三者複合体の構造をクライオ電顕/X線結晶構造解析SAD法により解析

 LbuCas13a/59-nt crRNA/30-nt target RNA strand 三者複合体(3.08 )

EMD-6777: LbuCas13a-crRNA二者複合体/5WTK: Crystal structure of RNP complex (2.651 )5WKT

The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a.” Liu L Zhang X, Wang Y (Inst. Biophysics). Cell. Available online 27 July 2017

 

[]E. coli cell-free transcription-translation systems 5 (TXTL)

Rapid and scalable characterization of CRISPR technologies using an E. coli cell-free transcription-translation system.” Marshall R, Maxwell CS, Collins SP, Luo ML, Jacobsen T, Beisel C, Noireaux V. bioRxiv Posted July 28, 2017.

 

[]トキソプラズマ感染に必須なセリン/スレオニンプロテインキナーゼ(PKG)の2種類のアイソフォームの機能を切り分ける

 必須遺伝子の機能解明に必要な条件付遺伝子発現を実現する手法として化学誘導二量体形成(chemically inducible dimerizationCID)法が開発されてきた。今回、トキソプラズマの遺伝子機能解析にこれまで利用されてきたラパマイシンの存在化で二量体化するタンパク質 FK506-binding proteinFKBP) とFKBP12-rapamycin-associated protein 1FRB)のシステムに変えて、植物由来のオーキシンを利用するオーキシンデグロンauxin-inducible degron, AID)法をトキソプラズマに最適化することで、細胞膜に局在するアイソフォームPKGIが感染・増殖に必要十分であり、サイトゾルに存在するアイソフォームPKGIIの機能は不十分であることを同定。 gondii

AID-ing Signaling in Toxoplasma gondii.Kim K. mBio. 2017 Jul 25;8(4). pii: e01076-17.

Plasma Membrane Association by N-Acylation Governs PKG Function in Toxoplasma gondii.” Brown KM, Long S, Sibley LD. mBio. 2017 May 2;8(3). pii: e00375-17.

 

[]ポリコーム(Pc)は、主として転写レベルが低い遺伝子に関与する

 本研究の一環として行った骨髄細胞におけるKit遺伝子の転写活性化実験において、CRISPR技術の1種であるSAMによる遺伝子発現活性化には5-AZA-Cが必であることが明らかになった。

Polycomb Responds to Low Levels of Transcription.

Berrozpe G, Bryant GO, Warpinski K, Spagna D, Narayan S, Shah S1, Ptashne M. Cell Rep. 2017 Jul 25;20(4):785-793.

 

[]PML/TRIM19(前骨髄球性白血病)蛋白質は、ヒト細胞においては、HIV-1初期感染を抑制しない

 マウス胚線維芽細胞において、マウスPMLとヒトPMLが、HIV-1その他のレンチウイルスの初期感染を阻害し、IFN-Iを介した機構とHIV-1の転写抑制の機構が報告されている。一方で、RNAiによる実験ではヒト細胞におけるウイルス感染阻害機能が判然としなかった。今回、CRISPR/Cas9によるノックアウトを始めとする実験により、ヒト細胞(上皮;リンパ;単球)においてはPMLはウイルス感染の制限因子ではないことが明らかになった。

Gene Knockout Shows That PML(TRIM19) Does Not Restrict the Early Stages of HIV-1. Infection in Human Cell Lines.” mSphere. 2017 Jun 21;2(3). pii: e00233-17.

 

[]線虫神経細胞における繊毛形成時のダイニンに依存する中心体の動態

 CRISPR/Cas9mMaple3::SAS4のノックインと、Cas9発現の熱ショック誘導によるsas-4, sas-5およびsas-6への条件付き変異誘導実験による解析 

Centriole translocation and degeneration during ciliogenesis in Caenorhabditis elegans neurons.”Li W, Yi P, Zhu Z, Zhang X, Li W, Ou G. EMBO J. 2017 Jul 25. pii: e201796883.

 

[][レビュー]ES細胞と遺伝子編集技術によりラットモデル新世代へ

 ES細胞,ラットES細胞確立、rES細胞における遺伝子ターゲッティング、ラットにおける遺伝子編集、ZFNTALENCRISPR/Cas(条件付き)ノックアウト、ssODNテンプレートを利用し大規模編集

From engineering to editing the rat genome.Meek S, Mashimo T, Burdon T. Mamm Genome. First Online: 27 July 2017

 

[] [レビュ] ウイルス持感染にする法:遺伝子サイレンシングとゲノム

 RNAiからCRISPR/Cas9まで;宿主ゲノムみウイルスゲノムの不活性化/活性化;課題(オフタゲット;率的送;免疫答;耐性)

Antiviral treatment strategies based on gene silencing and genome editing.

Badia R, Ballana E, Esté JA, Riveira-Muñoz E. Curr Opin Virol. 2017 Jun;24:46-54.

 

[] [レビュー] 中国における植物を対象としたゲノム編集技術と応用の状況、関連規制の国際動向及び中国におけるゲノム編集食品リスク評価の枠組み

Risk Analysis for Genome Editing-Derived Food Safety in China.”

Gao W, Xu WT, Huang KL, Guo M, Luo YB. Food Control, 2017. Available online 25 July 2017.

 

[10] [レビュー] lncRNAsの発生と疾患に関わる機能と機構

 CRISPR技術を利用した成果も紹介
lncRNAs in development and disease: from functions to mechanisms.”

Delás MJ, Hannon GJ. Open Biol. 2017 Jul;7(7). pii: 170121.

[11] [レビュー] 幹細胞の操作、遺伝子治療及び癌幹細胞

 造血幹細胞と再生医療/遺伝子治療(CRISPR/Cas9);間葉系幹細胞の特性と臨床応用;ESCからiPSC

Stem cell manipulation, gene therapy and the risk of cancer stem cell emergence.

Clément F Maguer-Satta V. Stem Cell Investig. July 2017.

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/03/30

  1. [論文] 必須タンパク質の機能解明に必須になる新たなタンパク質分解法:鐘巻将人 (国立遺伝学研究所)
    • 生命維持に必須なタンパク質の機能解明には、タンパク質を極めて短時間で分解あるいは不活性化し、それにともなう表現型の変化を観察する技術が必要である.短い二重鎖RNA(siRNA)によるタンパク質発現抑制はタンパク質が消失するまで長期間を要し、また、CRISPR/Cas9による必須遺伝子のノックアウトは効率が低い.これらに対して、鐘巻(当時、阪大)らがNature Methods (2009年)に発表したオーキシン依存的タンパク質分解系(auxin-inducible degron (AID)システム)は、植物由来のオーキシンによって短時間でタンパク質分解を可逆的に操作可能にした技術である.
    • AIDはこれまで動物細胞と菌類に展開されてきたが、今回、CRISPR/Cas9によるdsDNAの相同組換え修復機構(HDR)によって、AIDタグを標的タンパク質の遺伝子にノックインを実現できたことによって、初めてヒト細胞への展開が可能になった.AIDタグは植物細胞由来AXU/IAAの68-aa断片(mini-AID)であり、別途細胞内で発現させるOsTIR1を介して標的タンパク質をユビキチン・プロテアソーム分解系へと誘導する.
    • ヒト結腸腺癌由来HTC116細胞において、核内のコヒーシン複合体のRAD21サブユニットを標的とした場合、オーキシン添加後17分で半減し、タンパク質消失と同時に細胞成長が停止した.分子量530 KDaの細胞質ダイニン複合体(DHC1)についてもタンパク質の消失と相応する表現型の改変が起こった.さらに、マウスES細胞において、ゲノム複製開始に関与するMCM2タンパク質についてもAID法の効果を実証することができた.
    • [プレスリリース] 国立遺伝学研究所・JST. “取り除けば働きがわかる~特定のヒト細胞内タンパク質を素早く取り除いて機能を探る方法を開発~” 平成28年3月25日
    • [YouTube]「植物ホルモンを利用してヒト細胞のタンパク質を迅速に発現制御する:オーキシンデグロン(AID)技術」 国立遺伝学研究所 分子細胞工学研究部門 教授 鐘巻将人(23:45)https://www.youtube.com/watch?v=41nxW_OdX-o
  2. [論文] 生殖細胞の直接スクリーニングによってゼブラフィッシュへの変異導入と解析を効率化:Ross N. W. Kettleborough (Wellcome Trust Sanger Institute)
    • CRISPR/Cas9によるゼブラフィッシュ変異体の作出・解析を目的とするスケーラブルなパイプラインを構築:編集効率の高いsgRNAのスクリーニングし再注入 → G0胚生成 → 精子由来DNAのアンプリコンの次世代シーケンシング(NGS)によりオス個体をスクリーニング → 体外受精により胚生成 → F1の遺伝子型をKASPで判定 → F1キャリアをスクリーニングして近交系間交配し表現型判定
    • このパイプラインによって、スクリーニングに加えて、変異アレルを保持する精子サンプルの凍結保存も可能になった.
  3. [論文] ゼブラフィッシュの精密ゲノム編集法:David Jonah Grunwald (University of Utah)
    • 相同組み換え用のドナー配列としてssDNAではなくdsDNAを使用し、また、I-Sce1メガヌクレアーゼをドナープラスミドに挿入することで、TALENおよびCRISPR/Casによる標的dsDNA切断の相同組換え修復(HR)の精度と効率を高め、」ゼブラフィッシュのゲノム編集ツールボックスを拡大.HRによって以下を実現:
      • 1コドン(1アミノ酸残基)の改変
      • エピトープをコードする配列の挿入により、内因性タンパク質をタグ付け
      • 内在プロモーターによる標的遺伝子座からのGFP発現
      • ヒトの心臓病に関連するカリウムチャネルの遺伝子KCNH2/HERG のホモログ kcnh6a 遺伝子を対象として、その必須エクソンに隣接してloxP サイトを挿入し、Cre リコンビナーゼによる条件付き変異導入を実現
    • [プレビュー] Arish N. Shah & Cecilia B. Moens. “Approaching Perfection: New Developments in Zebrafish Genome Engineering” Dev. Cell. 2016 Mar 21;36(6):595-596.
  4. [論文] カイコにおけるCRISPR標的サイトの拡張:Yongping Huang; Anjiang Tan (Shanghai Institutes for Biological Sciences)
    • CRISPR/Cas9によるゲノム編集においてsgRNA標的サイトは通常GN19NGGまたはGGN18NGGから設計される.RNA Pol Ⅲプロモーターに対応する開始ヌクレオチド制限のためである.これに対して、Bombyx mori のU6プロモーターは、N20NGGのsgRNAsをin vivo /in vitro で発現す
  5. [論文] 聾唖者由来iPSCの変異遺伝子の修復:Jin-Fu Wang (浙江大学)
    • MYO7A の複合ヘテロ接合体(c.1184G>A/c.4118C>T)の聾唖患者由来のiPSC細胞のc.4118C>T変異をCRISPR/Cas9で修復し、形態ならびに機能においても内耳有毛細胞に相当する細胞への分化を実現.

◇ ◇ ◇  2017年7月ScienceCrispツイートから
# 1
5WKT
# 2

5V8KHbRC structure; 2017/07/31 AUTH -- 編集処理済、登録者の確認・同意待ち
# 3
5VRE:crystal structure of a lysosomal potassium-selective channel TMEM175 homolog from Chamaesiphon Minutus (3.299 Å)
# 4
5VN8:Cryo-EM model of B41 SOSIP.664 in complex with fragment antigen binding variable domain of b12
5VN3:Cryo-EM model of B41 SOSIP.664 in complex with soluble CD4 (D1-D2) and fragment antigen binding variable domain of 17b
EMD-8717 EMD-8716 EMD-8715 EMD-8714 EMD-8713
# 5   
5XMIATP-bound Vps4E233Q hexamer; 2017/07/31 AUTH -- 編集処理済、登録者の確認・同意待ち 2017/07/31
5XMKATP-bound Vps4E233Q–Vta1 complex; 2017/07/31 AUTH -- 編集処理済、登録者の確認・同意待ち 
EMD-6735 (without mask), EMD-6733 (with mask), EMD-6736 (without mask) and EMD-6734 (with mask) 20170731 未公開
# 6
5VI8: Structure of a mycobacterium smegmatis transcription initiation complex with an upstream-fork promoter fragment (2.76 Å)
# 7
5VYC: Crystal structure of the human 40S ribosomal subunit in complex with DENR-MCT-1 (6 Å)
# 8
5OA9: Human translation re-initiation complex containing eIF2D (1.8 Å)
5OA3eIF2D complex;   20170731 REPL -- 登録者より新しい座標を受理、再処理が必要
EMD-3770: 20170731 未公開

# 9
5W81: Phosphorylated, ATP-bound structure of zebrafish cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
EMD-8782 (3.37 Å)
#10
EMD-6770 20170731 未公開
5XSYEeNav1.4-β1 complex; 20170731 REPL -- 登録者より新しい座標を受理、再処理が必要
#11
#12
5VVJ: half-site-bound; 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
5VVK; pseudo-full-site-bound;
 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
5VVL:pseudo-full-site-bound with Ni
2+; 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
EMD-8827 20170731 未公開
5WFE: 20170731 REPL -- 登録者より新しい座標を受理、再処理が必要
#13
"spectroscopic (namely, fluorescence, NMR, and CD) and biochemical (proteolysis degradation) ; protein ligation assay (PLA); NUPR1 knock-out cells by CRISPR/Cas9n"
#14
#15
5TUD: Structural Insights into the Extracellular Recognition of the Human Serotonin 2B Receptor by an Antibody (3 Å)
#16
"Countermeasures Against Chemical Threats (CounterACT) project... how to combat toxic nerve agents such as sarin and VX"
#17
"15,000 de novo designed miniproteins.....2500 stable designed proteins in four basic folds"
#18
5X1F/5X1B/5X19: 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
#19
EMD-8750 20170731 未公開
5W0S: 20170731 AUTH -- 編集処理済、登録者の確認・同意待ち
#20
EMD-8749the complex of Streptococcus progenies Cas9 with sgRNA and AcrIIA4 (3.9Å)
5VZLcryo-EM structure of the Cas9-sgRNA-AcrIIA4 anti-CRISPR complex
#21
5NNV: Structure of a Bacillus subtilis Smc coiled coil middle fragment (3.295 Å)
5NMO: Structure of the Bacillus subtilis Smc Joint domain (1.899 Å)
5XEI: Crystal structure of the Smc head domain with a coiled coil and joint derived from Pyrococcus yayanosii (2.599 Å)
5XG2: Crystal structure of a coiled-coil segment (residues 345-468 and 694-814) of Pyrococcus yayanosii Smc (2 Å)
5XG3: Crystal structure of the ATPgS-engaged Smc head domain with an extended coiled coil bound to the C-terminal domain of ScpA derived from Bacillus subtilis (3.5 Å)
5XNS: 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち 
#22
3WV6: Crystal Structure of a protease-resistant mutant form of human galectin-9 (1.95 Å)
#23
5UJ6: Crystal Structure of Bacteroides Uniformis beta-glucuronidase (1.9 Å)
#24
5V6P: Hrd1 dimer; 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
5V7V: Hrd3 monomer; 20170731 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
EMD-8639: CryoEM map of Hrd1 dimer with one Hrd3 molecule(4.7Å)
EMD-8638: Cryo-EM map of the ERAD components Hrd1/Hrd3 dimer(4.7Å)
#25
#26
5N6H: Structure of the membrane integral lipoprotein N-acyltransferase Lnt from E. coli (2.9 Å)
5N6L: Structure of the membrane integral lipoprotein N-acyltransferase Lnt C387A mutant from E. coli (2.9 Å)
5N6M: Structure of the membrane integral lipoprotein N-acyltransferase Lnt from P. aeruginosa (3.1 Å)
#27
5XRA: Crystal structure of the human CB1 in complex with agonist AM11542 (2.8 Å)
5XR8: Crystal structure of the human CB1 in complex with agonist AM841 (2.95 Å)
#28
EMD-3741: Structure of Paired Helical Filaments from Alzheimer's Disease Brain (らせん対称再構成法, 3.4 Å)
EMD-3742: Pronase-treated paired helical filament in Alzheimer's disease brain (らせん対称再構成法, 3.5 Å)
EMD-3743: Straight filament in Alzheimer's disease brain (らせん対称再構成法, 3.4 Å)
EMD-3744: Pronase-treated straight filament in Alzheimer's disease brain (らせん対称再構成法, 4.9 Å)
5O3L: Paired helical filament in Alzheimer's disease brain
5O3O: Pronase-treated paired helical filament in Alzheimer's disease brain
5O3T: Straight filament in Alzheimer's disease brain
#29
5V3W: Crystal Structure of the Apo form of Thioesterase domain of Mtb Pks13 (1.723 Å)
5V3X: Crystal Structure of Mtb Pks13 Thioesterase domain in complex with inhibitor TAM1 (1.936 Å)
5V3Y: Crystal Structure of Mtb Pks13 Thioesterase domain in complex with inhibitor TAM16 (1.98 Å)
5V3Z: Crystal Structure of the D1607N mutant form of Thioesterase domain of Mtb Pks13 (1.881 Å)
5V40: Crystal Structure of Mtb Pks13 Thioesterase domain in complex with inhibitor TAM6 (1.991 Å)
5V41: Crystal Structure of Mtb Pks13 Thioesterase domain in complex with inhibitor TAM5 (2.051 Å)
5V42: Crystal Structure of Mtb Pks13 Thioesterase domain in complex with inhibitor TAM3 (1.987 Å)
#30
#31
#32
EMD-8478: 3.3 angstrom EM map of Type 1-E Cascade in the full R-loop state from Thermobifida fusca (3.3 Å)
5U0A: 20170730 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち
EMD-8477: (3.8 Å)
5U07: 20170730 HPUB -- 編集処理完了、論文の公開まで公開待ち

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/02/032017/07/30 米国動向など追記(*)

  • 英国のヒト受精・胎生学管理機関 (Human Fertilisation and Embryology Authority: HFEA) は2016年2月1日、Francis Crick 
    InstituteのKathy Niakan
    に、CRISPR/Cas9によるヒト胚ゲノム編集研究実施を認可した(ライセンスを付与した).
  • HFEAは、英国において1990年に制定されたヒト胚の取扱いに関する法律(Human Fertilisation and Embryology Act: HFE 
    Act)に基づいて1991年に設立された規制機関であり、これまでに審査の上、胚を対象とする研究を実施する機関にライセンスを付与してきた. Francis Crick Instituteはすでに胚を使用する研究のライセンスを取得していたが、今回、ゲノム編集の使用についてライセンスを取得した.
  • Kathy Niakanらは不妊症の機構解明を目的として、健常な胚発生過程を一細胞から256細胞に至る7日間に重要な働きをする遺伝子を分析するとしている.例えば、OCT4POU5F1 )の阻害実験を行う.胚は、体外受精の際にインフォームドコンセントを得た余剰の胚を使用する.
  • 胚の使用は研究に限定され、体外受精に使用することは認められていない.
  • 今後、研究所において倫理委員会の承認を得たのちに、実験研究が開始される.
  • [参考資料] HFEAからの情報および各種報道(2016 Feb 1)
    HFEAアナウンスHFEA approves licence application to use gene editing in research.
    HFEA License Committee 議事録:Thursday 14 January 2016. 
    BBCニュースScientists get 'gene editing' go-ahead. 
    The Wall Street JournalニュースU.K. Regulator Approves Technique to Genetically Modify Human Embryos.
    Science ニュースU.K. researcher receives permission to edit genes in human embryos. 
    Nature ニュースUK scientists gain licence to edit genes in human embryos. 
  • (*)
    20170726 米国でヒト胚ゲノム編集実施か
    米国アカデミー「ヒトゲノム編集」報告書
    National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance. Washington, DC: The National Academies Press. https://doi.org/10.17226/24623
    日本学術会議「医学・医療領域におけるゲノム編集技術のあり方検討委員会」資料
    http://www.scj.go.jp/ja/member/iinkai/genome/genome.html


8.ヒトβグロビン遺伝子座調節領域(LCR)の高感受性部位の赤血球特異的転写因子結合モチーフを標的とするCRISPR/Cas9編集
 主として20bp未満の領域を削除;個々の転写因子の不活性化の影響を、他の転写因子とは独立に解析可能に
9.CRISPR/Cas9によるStaphylococcus aureusの効率的ゲノム編集
 cas9遺伝子発現にPxyl/tetプロモーター、gRNA発現にPspacプロモーター、ドナーDNAのコンストラクト;tgt/rocA遺伝子削除とerm Rカセット挿入をスカーレスで実現
10.[レビュー] バクテリア免疫システムのモデリングとバイオインフォマティクス:CRISPR/Cas9および制限酵素システムの発現調節を理解する
11.並べ替えに基づいたノンパラメトリック手法(PBNPA)によるCRISPRスクリーニング・データ解析
 Rパッケージ入手先:https://cran.r-project.org/web/packages/PBNPA/
12.CRISPR関連情報を集約したWebサイト
 挿入図は2017/07/27にWebサイトからキャプチャCRISPR Web
13.hPSCの挿入/削除効率80%i以上を実現し、Cas9の毒性がtp53依存であることを同定
14.CRISPR特許係争は続く
 CRISPR Therapeutics, Intellia Therapeutics, Caribou BiosciencesそしてERS Genomicsの発表:カリフォルニア大学、ウイーン大学ならびにE Charpentierが、2017年2月15日のUSTPO PTAB裁定の破棄( reversal of the PTAB’s decision)を巡回裁判所に上訴


 

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