2017年09月

[注] Acknowledgmentsにおける記述("Platform for Drug Discovery, Informatics, and Structural Life Science"; "Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research" ; "Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research")から推定した「創薬等支援技術基盤プラットフォーム事業」と「創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業」の成果


































. 皮膚埋め込み血糖値センサーを、上皮幹細胞のCRISPRゲノム編集により実現

  • 【出典】“Development of an Intrinsic Skin Sensor for Blood Glucose Level with CRISPR-mediated Genome Editing in Epidermal Stem Cells” Yue J, Li Y, Gou X, Wu X. bioRxiv Posted September 28, 2017.
  • マウス無細胞化真皮上で培養したマウス上皮幹細胞を、気相液相界面に暴露することで層化し、皮膚様のオルガノイドを生成、野生型マウスに移植することで、長期間定着。この同質遺伝子的移植プラットフォームを利用することで、挿入図にある遺伝子編集を加えたマウス上皮幹細胞を、血糖値をin vivoで測定可能とするバイオセンサーとして利用可能なことを示した。skin epidermal stem cells
  • 挿入図にあるGGBPレポーターにさらにGLP1とマウスIgG-Fcフラグメントの発現カセットを加えることで、GLP1-Fc融合タンパク質の発現・分泌と、血中のGLP1レベル上昇を実現した。GLP1/GGBP発現細胞を移植したCD1マウスでは、高脂肪食による肥満化が有意に抑制された。
  • 本手法は、糖尿病の診断・治療への応用に鍵らず、他の疾病の診断・治療へと展開可能である。

2アレル特異的PCRアッセイに基づきゼブラフィッシュへの点変異ノックインの最適化を実現

  • 【出典】“Successful optimization of CRISPR/Cas9-mediated defined point mutation knock-in using allele-specific PCR assays in zebrafish” Prykhozhij SV,   Berman JN. bioRxiv Posted September 27, 2017
  • ゼブラフィッシュにおける一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)を修復テンプレートとするHDRを介した点変異ノックインの最適化;tp53cdh5およびlmna遺伝子をモデルとしてアンチセンス非対称オリゴの利用をはじめとする既報の最適化法を評価;tp53では、相同アーム35-nt90-ntを伴う126-ntテンプレートで効率が3〜10倍になり、F1世代への伝達率も20-40%に;AS-PCRにより偽陽性ノックインを検出。

3.DNAミスマッチ修復機構の影響を受けないリボソーム結合部位改変用オリゴ・ライブラリーの構築

  • 【出典】“Efficient engineering of chromosomal ribosome binding site libraries in mismatch repair proficient Escherichia coli” Oesterle S, Gerngross D, Schmitt S, Roberts TM, Panke S. Sci Rep. 2017 Sep 26;7(1):12327.
  • リボソ合部位(RBS)集による遺伝発現レベル調節は、原核生物の遺伝子回路や代パスウエイの最適設計に有用な手法である。6-bpから8-bpの小さな域を改することで、遺伝子翻の上方あるいは下方制御が可能であり、改のためのオリゴのライブラリー設計法も、RBS library calculatorMAGE Oligo Design Tool (MODEST)Empiric Model and Oligos for Protein Expression Changes (EMOPEC)Reduced Libraries (RedLibs)と数多く提案されてきている。
  • しかし、ライブラリーをCRISPR/Cas9遺伝集技によってホストに入すると、ホストに内在するDNAミスマッチ修MMR能が誘導され、RBS域の改変が起こらない場合がある。GLOS-RedLibs-supported library design
  • MMRはミスマッチのタイプとさに依存する。今回、オフタゲット変異度が高いMMR株の利用や、一段操作がえるMMRの一的不活性化の手段を取らず、MMRを回避可能なgenome-libraryoptimized-sequences (GLOS)をあらかじめ選択可能にするルルを整えることで(参照)この限界を突破可能なことを、E. ColilacZ遺伝子のRBSと、ビタミンB2生合成パスウエイの改への用で実証した。

4. dCas9が標的を探索する動態:E. coliS. pyogenesにて

  • 【出典】“Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli” Jones DL, Leroy P, Unoson C, Fange D, Ćurić V, Lawson MJ, Elf J. Science. 2017 Sep 29;357(6358):1420-1424.
  • Ypetで標識したdCas9を、36箇所のlacO1-結合サイトが組み込まれたpSMARTプラスミドを帯びたE. coli細胞で発現、isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)の添加または除去により、lacO1-結合サイトからのLacIの遊離またはlacO1-結合サイトへのLacIの結合を開始させることで、dCas9-YpetlacO1-結合サイトへの結合可能性をオン・オフするプラットフォームを開発し、dCas9の動態を蛍光顕微鏡で単分子観察し、PCRで解析した。
  • その結果、dCas9は標的発見までに6時間を要し、標的候補への結合は30ms未満と見積もられ、標的に結合後は複製完了まで結合し続けることを見出した。探索時間を短縮するためには、dCas9sgRNAの濃度を高めることが必要である。
  • 一方で、S. pyogenesではCas9量がE. coli中のdCas9量のほぼ2倍にあたり、標的探索時間は1分程度と見積もられた。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/03/05
  • Eduardo PerozoSriram Subramaniamら、 University of ChicagoとNCIの研究チームは、クライオ電顕単粒子再構成法によって、Thermotoga maritima のマグネシウムチャネルCorAの閉構造と2種類の開構造をそれぞれ分解能3.8Åと分解能7.06Åで解き、5回対称の閉構造から非対称な開構造へと遷移するモデルを提唱した.
  • CorAは原核生物の主要なマグネシウム取り込み装置であり、細胞内のMg2+が低濃度になると細胞外からMg2+を取り込む.これまでに、X線結晶構造解析は閉構造と開構造が同じようなコンフォメーションをとることを示唆したが、電子スピン共鳴(ESR)分光法は大きなコンフォメーション変化を示唆していた.
  • CorAは5つのサブユニットで構成され、細胞質側に広がっている漏斗状の五量体である(挿入図3JCF参照).35450001
    細胞内のMg2+が高濃度の場合は、Mg2+がサブユニット間の界面に入り込み、五回回転対称の構造を取っている(挿入図は3JCFを細胞質側から見た図とペリプラスム側からみた図).
     35450002 35450003
  • サブユニットにはストークヘリックスと呼ばれる長い(残基の249から351までに相当)ヘリックスが存在する.このストークヘリックスのC末端が膜貫通ドメインのTM1を(膜貫通ドメインにはTM2も存在)構成し、N末端が細胞質内の漏斗の外側を構成している.
  • Mg2+がサブユニット間に結合していない開構造のCorAでは、5つのサブユニットのうち4つのサブユニットにおけるストークヘリックスの細胞内領域がそれぞれ順次にイオン透過経路に対して傾きを変え(透過経路から離れる方向へ 〜35°/透過経路に近づく方向へ 〜24°)、結果的に透過経路に対してサブユニットが1025Å変位し、開構造での対称性は失われる(2つのサブユニット変位が挿入図Ⅰ(3JCG)に、4つのサブユニット変位が挿入図Ⅱ(3JCH)に相当).
    35450004 35450005
  • Mg2+の結合によって安定する5回対称構造は、長く狭い透過経路と水和したMg2+ とが相容れないために、Mg2+ が透過できない閉構造となると考えられる.
  • サブユニット間からMg2+ が抜けると、細胞質で大きなコンフォメーション変化が起こるとともに、狭い透過経路の疎水性ゲート領域を含むチャネル全体の柔軟性が増すことによって、Mg2+ が透過可能になると想定した.
  • [論文] Darmanis, S. et al. "Cryo-EM Structures of the Magnesium Channel CorA Reveal Symmetry Break upon Gating." Cell. 2016 Feb 11;164(4):747-56.
    PreviewMinor, D. L. Jr. ."Let It Go and Open Up, an Ensemble of Ion Channel Active States.Let It Go and Open Up, an Ensemble of Ion Channel Active States." Cell. 2016 Feb11;164(4):597-8.
    [EMデータ] EMD-6551: Reconstruction of Thermotoga maritima CorA in the presence of magnesium(分解能 3.8 Å)
    [構造] 3JCF: Cryo-EM structure of the magnesium channel CorA in the closed symmetric magnesium-bound state.
    [EMデータ]EMD-6552: Reconstruction of Thermotoga maritima CorA in the absence of magnesium resulting in at least two(分解能 7.06 Å)
    [構造] 3JCG: Cryo-EM structure of the magnesium channel CorA in the magnesium-free, asymmetric open state I.
    [EMデータ] EMD-6553: Reconstruction of Thermotoga maritima CorA in the absence of magnesium resulting in at least two(分解能 7.06 Å)
    [構造] 3JCH: Cryo-EM structure of the magnesium channel CorA in the magnesium-free, asymmetric open state II.

1.光スイッチを伴う一本鎖Cas9を開発


2.[レビュー] 新たな癌療法開発の基盤データとなる遺伝子相互作用のin silico同定

  • 【出典】“Computational Approaches to Identify Genetic Interactions for Cancer Therapeutics” Benstead-Hume G, Wooller SK, Pearl FMG. J Integr Bioinform. 2017 Sep 23;14(3). https://doi.org/10.1515/jib-2017-0027
  • 癌療法開発に有用な遺伝子相互作用は、synthetic sensitivity lethality (SSL)synthetic dosage lethality (SDL)の関係である
  • SSLは2つ以上の遺伝子のセットについて、個々の遺伝子が機能喪失した場合は細胞不全に至らないが、全ての遺伝子が機能喪失した場合は細胞不全に至る関系;細胞死に至る場合はSynthetic Leathal(合成致死)、細胞死までに至らない場合は‘synthetic sensitive’または‘synthetic sick’
  • SDLは、遺伝子Aが過剰発現し、遺伝子Bが機能喪失した場合に細胞死に至る関係を言う。
  • SSLに焦点をあてながら、ハイスループットでの遺伝子間相互作用同定を目指したウエット実験のプラットフォームと、in silicoでの遺伝子間相互作用の推定に必要なデータ資源とアルゴリズムをレビュー。また、合成致死データを入手可能なデータ資源を取りまとめ(Table2)。

3.[展望] CRISPR関連ポリメラーゼを介したオリゴヌクレオチドを二次情報伝達物質の発見が解決した謎と生み出した謎

  • 【出典】”Discovery of oligonucleotide signaling mediated by CRISPR-associated polymerases solves two puzzles but leaves an enigma” Koonin EV, Makarova KS. ACS Chem Biol. September 22, 2017.
  • 20176月に2つの研究グループがそれぞれNature誌とScience誌に発表した「タイプⅢ CRISPR-CasシステムにおけるウイルスDNAからの転写物RNA切断に、サイクリックアデニル酸が、セカンドメッセンジャーとして機能する(*)」とする論文に触発された考察
  • (*) 【関連ブログ記事】CRISPRメモ_2017/08/07-3「3.バクテリアの獲得免疫機構におけるセカンドメッセンジャー発見」
  • タイプⅢCRISPR-Casシステムの特徴であるCas10Palmドメインと、タイプⅢとタイプⅠの一部に存在するCRAF (CRISPR-associated Rossmann fold)ドメインの機能がようやく明らかにされた。すなわち、Cas10が触媒合成するオリゴアデニレートがCsm6タンパク質のCRAFドメインに結合し、侵入DNAの転写物を切断するRNアーゼドメインを活性化する免疫応答パスウエーの存在が明らかにされた。一方で、このパスウエイの調節機構と進化機構という新たな謎が生まれた。

4.GuideFinder:任意のバクテリアについて、完全ゲノムまたはドラフトゲノムからCRISPRi/CRISPRagRNAsを同定可能とするプログラム

  • 【出典】“A universal, genome-wide guide finder for CRISPR/Cas9 targeting in microbial genomes” Spoto M, Fleming E, Oh J. bioRxiv Posted September 27, 2017
  • NGG PAMサイトを認識し、利用者が設定するパラメーターに応じてゲノムを検索。
  • プログラム入手先:https://github.com/ohlab/Guide-Finder

5. [レビュー] 嚢胞性線維症(CF)のモデルとなる動物と細胞の構築

  • 【出典】“Animal and model systems for studying cystic fibrosis” Rosen BH, Chanson M, Gawenis LR, Liu J, Sofoluwe A, Zoso A, Engelhardt JF. J Cyst Fibros. 2017 Sep 19. pii: S1569-1993(17)30880-9.
  • CF疾患のモデリングと新たな療法の検証を可能にする動物モデルと細胞モデル開発の鍵となる技術を評価:CRISPR/Cas9技術により、細胞株と初代培養細胞において、CFの病因分子であるcystic fibrosis transmembrane conductance regulatorCFTR)のin vitroモデリングの可能性が広がった。また、CRISPR/Cas9技術による体性幹細胞とiPSCsにおけるCFTR変異の遺伝子編集が、CFの遺伝子治療の可能性を広げた。

6.[レビュー] アピコンプレックス門寄生虫の遺伝子操作法の進展      


7. [プロトコル] Agrobacterium rhizogenesを介した毛状根形質転換技術によるアビシニアガラシ(Brassica carinata)変異体の効率的作出

  • 【出典】“Efficient generation of mutations mediated by CRISPR/Cas9 in the hairy root transformation system of Brassica carinata”         Kirchner TW, Niehaus M, Debener T, Schenk MK, Herde M. PLoS One 2017 Sep 22;12(9):e0185429.
  • FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 1 (BcFLA1)遺伝子をモデルとして、遺伝子変異と表現型変異の誘導を実証。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による遺伝子編集の評価も提案。
    Brassica carinata 1 Brassica carinata 2

  • 【出典】“Massively parallel de novo protein design for targeted therapeutics.” Chevalier A, Baker D. Nature. Published online 27 September 2017
     小型(412 kDa)のタンパク質には、低分子よりも特異性が高く設計が容易であり、モノクローナル抗体よりも安定で化学合成が容易なことから、低分子化合物とモノクローナル抗体のギャップを埋めることが期待される。これまで天然物由来スキャフォールドから定向進化による小型タンパク質作出が試みられてきたが、DNA合成技術の進歩とともに、デノボでの小型タンパク質の設計と合成が現実になりつつある。
  • David Bakerらの研究チームはScience2017714日号にて、1万5千種類以上のミニタンパク質をデノボ設計・発現・評価し、安定な非天然ミニタンパク質2,788種類を得たことを報告(*)していたところ、9月27日のNatureオンライン版では、インフルエンザウイルス A H1ヘマグルチニン(HA)とボツリヌス毒素BBoNT/B)に高親和性で結合するミニタンパク質のデノボ設計・発現・同定に成功したことを報告した。
    (*) ブログ記事20170718日「データ駆動型タンパク質工学の始まり:1万5千以上のミニタンパク質を設計・合成、安定な非天然タンパク質2,788種を同定」参照
  • 5種類のトポロジー(HHH, EHEE, HEE, EEHEおよびHEEHHはαヘリックス/Eはβ-ストランド)と多様なジスルフィド結合を組み合わせた4,000種類を超える主鎖群からなるスキャフォールドの仮想ライブラリーを準備し、そのヘリックス部分を既報のHA及びBoNT/B複合体の界面のヘリックス部分あるいはBoNT/Bの天然標的と重ね合わせ、ホットスポット残基を含み、ホットスポット以外の残基を結合親和性とモノマー安定性を最大にするようにRosetta法で選択することで、新たな界面を生成した。
  • HAに対する7,276種類の設計とBoNTに対する3,406種類の設計、及びコントロール用の6,286種類の設計、をコードするオリゴを合成し、計16,968種類のタンパク質を発現させた酵母ライブラリーを蛍光標識した様々な濃度の標的と共培養し、標的が結合した細胞をFACSで選別し、ディープシーケンシングにより選別されたプールごとにエンリッチされた設計を同定した。実験から得られた結合活性を左右する要因(配列と構造の適合性、界面を介したコンタクト数)に関する知見を元に設計プロトコルを改良し、標的結合設計の範囲を広げた。
  • 標的に対して高い結合親和性を示すミニタンク質(バインダー)を2,618種類同定し、そのうち6種類のHAバインダーと8種類のBoNTバインダーを化学合成またはE. coliで発現し詳細に解析した。
  • ミニタンパク質は極めて安定であり、抗体と異なり高温でも活性を失なわず、免疫応答も引き起こさないことを確認した。
  • また、最も活性が高いHA標的ミニタンパク質をモデルマウスの鼻内に、インフルエンザウイスに暴露する前または暴露後72時間以内に最も活性がスプレーすることで、マウスをインフルエンザから保護することができた。この効果は、静脈内投与した場合は見られなかった。

↑このページのトップヘ