2018年05月

出典
  • Targeting wild-type KRAS-amplified gastroesophageal cancer through combined MEK and SHP2 inhibition. Wong GS [..] Catenacci D, Bass AJ. Nat Med. 2018 May 28.
背景
  • KRAS遺伝子変異に起因するKARSタンパク質の変異は膵臓癌の97.7%、大腸癌の44.7%および肺癌の30.9%をはじめとして多くの癌にみられ (Table 1 - Nat Rev Drug Discov 2014) 、変異によるKRAS活性の亢進が癌をドライブすることが定説になっている。
  • Dana-Farber研究所、シカゴ大学、OncoPlex Diagnostics/NantOmics などの研究グループは今回、KRAS遺伝子のコーディング領域の変異ではなく、野生型KRAS遺伝子の高レベルの増幅によるKRASの活性化に注目した。
  • KRAS遺伝子増幅は、食道腺癌、胃腺癌および卵巣腺癌によく見られる。KRAS遺伝子が増幅している胃腺癌モデルはMAPK阻害剤に対して、KRASタンパク質が顕著に過剰発現し、KRAS-GTPレベルが急激に上昇することでMAPK阻害に適応可能となりMAPK阻害剤に対して感受性を示さなくなる。
成果
  • 研究グループは今回、KRAS遺伝子増幅癌のMAPK阻害剤への適応能力が、グアニンヌクレオチド交換因子であるSOS1SOS2  またはチロシンホスファターゼのSHP2 の阻害によって減ずることを見出した (下図はSHP2が制御する細胞内シグナル伝達経路)。
SHP2 SOS
  • また、具体的に前述因子を遺伝学的および薬理学的に阻害することで、KRAS遺伝子増幅が起きている癌のMEK阻害に対する感受性がin vitroでもin vivoでも亢進することを見出した。
  • KRAS遺伝子のコピー数増加がKRASの活性化を誘導することが明確になり、SHP2とMEKの同時阻害がKRAS遺伝子コピーが増加している癌に対する有効な療法となる可能性が示された。
参考文献・記事

出典
  • "A novel three-dimensional high-throughput screening approach identifies inducers of a mutant KRAS selective lethal phenotype". Kota S[..]Kissil J, Spicer Tp. Oncogene. 2018 May 10.
背景
  • RASタンパク質は膵臓癌、肺癌、および大腸癌など癌において最も高頻度で変異が起きているタンパク質であり、また、腫瘍細胞の増殖そしてまたは生存がRASに依存することから、RASは明らかに癌治療の格好の標的である。しかし、30年以上にわたりRASは'undruggable'と称されてきた。サイズが小さく低分子が結合可能なポケットが見当らないといったタンパク質自身の特性に加えて上流の調節ネットワークが複雑なことから、RASより下流のシグナル伝達過程を標的とする試みがなされてきたが、それもまた複雑であり、RAS阻害剤の研究開発は停滞していた。
  • 多数の因子が関わるシグナル伝達過程を標的とする創薬には、分子標的を特定した上のtarget-based screening (target-based drug discorvery: TDD)よりも、細胞の生存性などの表現型に基づくスクリーニング (phenotypic drug discovery: PDD) が有用である。表現型スクリーンのポイントは、いかに体内環境に近い微小環境でスクリーンするかにかかっている。
成果
  • The Scripps Research Instituteの研究チームは今回、三次元細胞培養で構築したサイズが〜100-600μm径の同質遺伝的背景のスフェロイド (spheroid)とハイスループットスクリーン技術を組み合わせることで、G12V変異KRASを選択的に阻害する低分子1種類、強心剤として利用されているプロスシラリジン (Proscillaridin) A、を同定した。
  • 今回見出した強心剤の抗癌剤候補へのドラッグリポジショニング/ ドラッグリパーパシング (drug repositioning/drug repurposing) は、生体内の3次元微小環境の再現が困難な付着性の細胞二次元単層でのスクリーンや、TDDでは、見出せなかった成果である。
参考文献
関連ツイート

1.塩基エディターBE4とABEを、BE4max/AncBE4max/ABEmaxへと強化
  • [出典] "Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction" Koblan LW, Doman JL, Wilson C, Levy JM, Tay T, Newby GA, Maianti JP, Raguram A,  Liu DR. Nat Biotechnol 2018 May 29.
  • 病因変異の多くを示す点変異の精密修復が塩基エディター(BE)技術によって実現した。BEは、不活性化したCas9と中立あるいは定方向分子進化させた核酸塩基デミアーゼ、および、手法によっては一塩基編集結果を保護するタンパク質とで構成される。シチジンBEのBE4とアデニンBEのABE7.10によって、ClinVarデータベース登録病原性SNPsの61%に見られるトランジション変異 (C-to-T; G-to-A; A-to-G; T-to-C)の修復が可能になった。BEはまた、植物、魚類、両生類およびヒト胚に成功裏に展開されてきた。しかし、標的サイトまたは細胞型では編集効率が著しく低いことが課題であった。
  • 予備実験において効率のボトルネックは遺伝子導入ではなく遺伝子発現にあることを同定
  • BE4max:BE4において核移行シグナル (NLS)をN末端とC末端ともにSV40NLSからbipartite NLSへ変更 (bis-bpNLS)することで効率を1.3倍に、続いて、コドン最適化法をIDTからGenScriptに変更することで さらに効率を1.8倍に
  • AncBE4max: APOBEC1シチジンデアミナーゼの発現向上を目指して、BE4maxのrAPOBEC1を、最尤法で構築したAPOBECの進化系統樹から推定した (Ancestral sequence reconstruction)祖先アミノ酸配列Anc689 (rABOBEC1の36のアミノ酸改変に相当)に差し替えたバージョンであり、HEK293T細胞における評価で、BE4maxを僅かに凌ぐ最も高い編集効率を達成;HEK293T細胞におけるmRNAとタンパク質の発現レベルで見るとBE4の5倍 (BE4maxは4倍)
  • ABEmax: BE4max開発と同様にABE7.10のSV40 NLSをbis-bpNLSに変更して効率~1.5-2倍に、コドン最適化により効率を1.3-7.9倍に。
  • 患者由来繊維芽細胞などにおける点変異修復と変異導入効率向上も実証
2.[プロトコル]蛍光タンパク質のホモ接合ノックイン細胞の生成と判定
  • [出典] "Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR–Cas9 genome editing" Koch B, Nijmeijer B, Kueblbeck M, Cai Y, Walther N, Ellenberg J. Nat Methods 2018 May 24.
  • 一対のCas9D10Aニッカーゼを利用した相同組換え修復 (HDR)を介した特定の遺伝子座への蛍光タグの挿入法と、挿入が起きた細胞を効率的に同定する実験のプロトコル詳細;形質導入から判定まで6~9日
3.Riemerella anatipestiferのタイプⅡ-C CRISPR-Casシステムにおけるスペーサ獲得はCas1とCas2に依存する
  • [出典] "Cas1 and Cas2 from the type II-C CRISPR-Cas system of Riemerella anatipestifer are required for spacer acquisition" He Y [..] Cheng AC [..] Zhang L. Front Cell Infect Microbiol 2018 May 24.
  • タイプⅡ-C CRISPR-Casシステムにおいても、タイプI-EシステムとII-Aシステムと同様に、Cas1とCas2の双方がスペーサー獲得に必要なことを同定
4.CRISPRMatch:ハイスループットCRISPRゲノム編集データ解析の自動化・可視化ツール
  • [出典] "CRISPRMatch: An Automatic Calculation and Visualization Tool for High-throughput CRISPR Genome-editing Data Analysis" You Q [..] Zhang Y, Zhang T. Int J Biol Sci 2018 May 22.
  • CRISPR-Cas9およびCRISPR-Cpf1で編集した結果の次世代シーケンシング (NGS)データによる判定を自動化しその結果を見やすく表示するパイプラインを開発し (下図参照)、ソースコードをGitHubで公開 
CRISPRMatch
5.DNA, mRNAおよびCas9/sgRNA RNPの送達に利用可能な汎用グルタチオン(GSH)応答性ナノプラットフォーム
  • [出典] "A Universal GSH-Responsive Nanoplatform for the Delivery of DNA, mRNA, and Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein" Chen G, Ma B, Wang Y, Gong S. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 May 25.
  • 遺伝子治療には効果的で安全な担体が必要であり未だ探索が続いている。米中の研究チームは今回、負に帯電した生体高分子を静電相互作用を介して結合し、効率的送達 (細胞内取込、エンドソームエスケープ、続いて、細胞質での積み荷放出)を実現するポリプレックス・システムを開発。
6.ヒツジ・ゲノムのトリオ解析から探ったCas9多重編集のオフターゲット作用
  • [出典] "Low incidence of SNVs and indels in trio genomes of Cas9-mediated multiplex edited sheep" Wang X [..] Huang X, Jiang Y, Chen Y. BMC Genom. 2018 May 25.
  • 多重度~25.8xのWGSトリオ解析により、ゲノム編集したヒツジの子孫における変異におけるde novo変異を同定 (下図参照);その中でオフターゲット変異は、2.4 kbの逆位の1件だけであった。
sheep
7.[特許公開] RNP (Cas9とgRNAの複合体)の評価、選択および設計法
[出典] "EVALUATION OF CAS9 MOLECULE/GUIDE RNA MOLECULE COMPLEXES" US20180135109. PubDate: 2018-05-17.  Inventors: Jayaram H, Selleck Jr.W. Assignee: EDITAS MEDICINE, INC.

1.[Research Highlight] CRISPR/Cas9が誘発する'scars' (indels)から細胞系譜を辿る
  • [出典] "Tracking development with DNA ‘scars’" Kling J. Lab Animal 2018 May 23.
  • 8連続GFPに刻まれる'scars'をもとにゼブラフィッシュ発生時の細胞系譜追跡を実現したAlemany等の研究成果をハイライト:[論文] "Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing" Alemany A [..] van Oudenaarden A. Nature. 2018 Apr 5;556(7699):108-112;[crisp_bio掲載記事] 2018-04-12 細胞バーコーディングとscRNA-seqを一体化して、細胞型の同定と細胞系譜再構築の一石二鳥を実現- 2 ScarTrace
2.CMGE:微生物セルファクトリーを目指したCRISPR/Cas9技術による大腸菌の多重ゲノム編集
  • [出典] "CRISPR/Cas9 assisted Multiplex Genome Editing (CMGE) Technique in Escherichia coli" Feng X, Zhao D, Zhang X, Ding X, Bi C. Biotechnol J. 2018 May 23.
  • CRISPR/Cas9の部品すべてを複製可能なプラスミドに組み込み、また、Cas9の発現を精密に誘導するCMGEを開発し4遺伝子座の効率的同時編集を実現:効率は、2遺伝子座標的で100%、3遺伝子座標的で83.3%、4遺伝子座標的で30% (これまでで最高)。
3.塩基エディターBE3で除草剤耐性スイカを作出
  • [出典] "Engineering herbicide-resistant watermelon variety through CRISPR/Cas9-mediated base-editing" Tian S, Jiang L [..] Xu Y. Plant Cell Rep. 2018 May 24.
  • アセト乳酸合成酵素 (ALS)遺伝子にBE3を適用し、除草剤耐性を付与
4.CRISPR/Cas9でホスホリパーゼC-delta 1 (PLCD1)をノックアウトしたマウスの体毛構造の異常と皮膚の組織学
  • [出典] "Abnormalities of hair structure and skin histology derived from CRISPR/Cas9-based knockout of phospholipase C-delta 1 in mice" Liu YM [..] Sun Y, Xiao D, Gu WW. J Transl Med. 2018 May 25;16(1):141.
  • CRISPR/Cas9によりF1世代でホモ接合PLCD1欠損マウスを得たが、完全なヘアレスの表現型を示さなかった。
5.CRISPR/Cas9によるマレック病 https://ja.wikipedia.org/wiki/マレック病 ウイルス (MDV-1)機能ゲノミクス
  • [出典] "Application of CRISPR/Cas9 Gene Editing System on MDV-1 Genome for the Study of Gene Function" Zhang Y, Tang N, Sadigh Y, Baigent S, Shen Z, Nair V, Yao Y. Viruses. 2018 May 24.
  • ニワトリ胚線維芽細胞にMDVのMeg遺伝子とpp38遺伝子を標的とするgRNA/Cas9発現ベクターを導入後、MDVのCVI988株を感染させ、シーケンシング、免疫蛍光法と変異株の増殖を解析し、CRISPR/Cas9がMDV機能ゲノミクスのツールとして有用なことを実証。
6.ヒッポ・シグナル伝達 においてYAPとTAZは独自な機能とともに冗長な機能も備えている
  • [出典] "The Hippo pathway effector proteins YAP and TAZ have both distinct and overlapping functions in the cell" Plouffe SW [..] Guan KL. J Biol Chem 2018 May 25.
  • HEK293A細胞においてCRISPR/Cas9によるYAP KO, TAZ KOおよびYAP/TAZ KOの結果を解析
7.EUのGMO規制の改正に関するオランダからの提案を歓迎
  • [出典] "[Science & Society]A Welcome Proposal to Amend the GMO Legislation of the EU" Eriksson D et al. Trends Biotechnol 2018 May 25.
  • オランダの提案は、GMOを再定義するのではなく、Annex 1Bの技術一覧を、一連の判断基準で置き換えるという提案。

1.縦列重複の増幅 (コピー数増加)が、癌細胞必須遺伝子のCRISPR-Cas9ドロップアウトスクリーンに偽陽性をもたらす
  • [出典] "Tandem duplications lead to loss of fitness effects in CRISPR-Cas9 data" Gonçalves E [..] Garnett MJ (Sanger Inst.). bioRxiv Posted May 25, 2018.
  • サンガー研究所、EBIおよびGSK グラクソ・スミスクラインの研究チームは、ゲノム構造多型がCRISPR-Cas9機能喪失 (LOF)スクリーン結果に与える偏りを体系的に探ることを目的として、17種類の腫瘍型にわたる163種類の癌細胞株における17,234遺伝子を対象とするCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーンに、全ゲノムシーケンシング (WGS)およびDNA SNP6.0コピー数多型アレイによる解析を加えて、各遺伝子の必須性と構造多型の相関を分析した。
  • 先行研究*からの報告と一致して、発現していない遺伝子も含めてコピー数が増加している遺伝子を標的とするsgRNAsが最も強いLOF効果を示すことを見出したが、同時に、その偏りが染色体の増幅 (倍数性)によって緩和されることも見出した。すなわち、コピー数の多い染色体ほど、CRISPR-Cas9のLOF効果を大きく低下させ、縦列反復が増幅した領域を標的とすると遺伝子の如何に関わらず細胞の適応性 (fitness)が大きく劣化する一方で、染色体の重複によって増幅した領域を標的としても細胞の適応度には影響を与えなかった (下図左参照)。
Tandem duplications collateral essenitalities
  • 研究チームは縦列重複増幅ターゲッティングに由来する'致死性'に注目して、162癌細胞株においてcollateral vulnerabilities (上図右 Figure 4-A参照 )の関係にある遺伝子対を探索し、40種類 (24.5%)の癌細胞株 において223例を同定した。その59.2%はCOSMICデータベースに格納されている53種類の癌ドライバー遺伝子との対であった (上図右 Figure 4 -C/Dは、乳癌細胞株AU565におけるNEUROD2ERBB2の例)
  • 研究チームはさらに、CRISPR-Cas9 LOFスクリーン結果に与えるゲノム構造の同定を支援するツールCrispy (a Python module: github)を開発した。
Crispy
2.高い多重度編集を実現するゴールデンゲート法とPol IIプロモーターに基づいたCRISPR/Cas9 gRNAアレイの効率的構築と発現
  • [出典] "Highly Multiplexed Genome Engineering Using CRISPR/Cas9 gRNA Arrays" Kurata M [..] Moriarity BS. bioRxiv Posted May 25, 2018.
  • 下図にあるような10種類までのgRNAを単一プロモーターから発現可能とするgRNAアレイを構築可能;gRNAアレイは、細胞内でCsy4リボヌクレアーゼにより個々のgRNAへと分離される。Multiplexed 4
3.CRISPRブレイクスルーのルーツを探る
  • [出典] "Pre-existing Technological Core and Roots for the CRISPR Breakthrough" Magee CL, Kleyn PW,  MonksBM, Betz U, Basnet S. bioRixv Posted May 24, 2018.
  • ゲノム工学の技術ドメインにおけるCRISPRブレイクスルーの技術的起源を客観的に辿った;CRISPR以前のゲノム編集を代表する特許を集積し、その特許間の引用関係のネットワークの分析から、3つの主要な軌跡を同定(下図参照)
Patent
4.ミミウイルス(mimivirus)のヴィロファージ(virophage)レジスタンス・エレメント (MIMIVIRE)システムに、Cas4様タンパク質を発見
  • [出典] "Structural and Mechanistic Analyses Reveal a Unique Cas4-like Protein in the Mimivirus Virophage Resistance Element (MIMIVIRE) System" Dou C [..] Cheng W. iScience 2018 May 25. PDB構造:5YET (wild-type R354 ); 5YEU (four-point mutation R354)
  • CRISPR様の“mimivirus virophage resistance element” (MIMIVIRE)システムの必須因子R354は、Cas4と配列同一性は低いが機能的なホモログであり、二重ヌクレアーゼ (エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼ)である (下図はmimivirusの概要図)。
Mimivirus

5.CRISPR技術によりハマダラカ (Anopheles)に効率良く部位特異的変異誘発
  • [出典] "Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR" Li M, Akbari OS, White BJ. G3 (Bethesda). 2018 Feb 2;8(2):653-658.
  • CRISPR/Cas9変異誘発技術がハマダラカの逆遺伝学のツールとして有用なことを、Anopheles albimanus, とA. coluzzii、加えてこれまで遺伝子操作の効率が極めて低かったA. funestusにおいて、white遺伝子を標的とする実験で実証 (下図);変異誘発の効率はsgRNAおよびCas9の濃度に依存
Anopheles mosquito

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