2018年05月

  • [出典] "Gold nanocrystal labels provide a sequence–to–3D structure map in SAXS reconstructions" Zettl T [..] Lipfert J. Sci Adv 2018 May 25;4(5):eaar4418
  • X線小角散乱 (small angle X-ray scattering: SAXS)のデータから、生理条件下から変性条件下まで任意の条件下の溶液中における生体高分子とその複合体の形を、結晶化することなく、ab initioで再構成することが可能である (X線溶液散乱法)。しかし、SAXSから得られる電子密度マップの分解能はX線結晶構造解析、NMRおよびクライオ電顕に及ばず、信頼性の高い二次構造あるいはドメイン構造まで明らかするには至らない。
  • ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン、スタンフォード大学およびハーバード大学の研究チームは今回、試料を金ナノ結晶 (半径 ~7 Å; ~80 原子)でラベルしておくと、金ナノ結晶ひいてはその結合残基を、SAXSデータから計算・再構成した生体高分子の低分解能の3D構造上に精密にマップすることが可能になり、したがって、配列のモチーフや2次構造、ドメインなどの配置を3D構造上で特定可能になることを、実証した。
  • これまでに1対の金ナノ結晶により残基を標識した試料を対象とするSAXS/異常小角散乱 (anomalous SAXS: ASAXS) 実験により残基間の距離を測定することで構造の詳細を明らかにする試みがなされてきたが、今回の手法の特徴は、単一の金ナノ結晶・残基の位置決めしていくところにある。
  • すなわち、下図 Fig. 1- Cにあるように金ナノ結晶でラベルしていない試料のSAXSデータからダミー残基またはビーズで構成される低分解能の構造モデル (以下、ビーズモデル)をab initioで再構成し、このビーズモデルに立体構造上結合可能な位置 (traial position)の全てについてそれぞれ金ナノ結晶が結合した場合について計算しておいたSAXS散乱プロファイルと、金ナノ結晶でラベルした試料からのSAXS散乱プロファイルとを照合していくことで、3D構造上で金ナノ結晶/残基の位置を特定する。
GOLD SAXS 1
  • 金ナノ結晶でラベルした試料からの散乱強度は、上図Fig. 1 - Bの式および下図Fig. 2のグラフが示唆するように金ナノ結晶単独、生体高分子単独、および、金ナノ結晶と生体高分子の交差項の3項の和になる。
GOLD-SAXS 2 GOLD-SAXS 3
  • 実証実験では、上図左Fig. 3とFig. 4にあるように、10-から35-bpの長さのdsDNA鎖の末端ラベル(ブルーの点が最適)、dsDNA鎖の内部ラベル、および上図Fgi.5 とFig. 6にあるようにRNAキンク・ターン構造の末端ラベルおよびカルモジュリンにおいてフレキシブルなαヘリックスのリンカーで結合された2つのローブ構造における誘導変異のラベル、において金ナノ結晶を3D構造上にマッピング可能なことを確認。
  • 今回開発した手法は、銀ナノ結晶やプラチナナノ結晶、および、cryo-EMへの展開が可能である。

  • 出典:"Using cryo-electron microscopy maps for X-ray structure determination" Zeng L, Ding W, Hao Q. IUCrJ 2018 May 11.
  • X線結晶構造解析とクライオ電顕 (cryo-EM)はタンパク質立体構造決定の相補的技術である。従来、より高分解能な構造情報を得るにX線結晶構造解析が有用であり、一方で、クライオ電顕 は大きなサイズの生体高分子の研究に有用とされてきた。
  • 近年、クライオ電顕の分解能が大きく向上して両者の分解能が接近し、生体高分子のクライオ電顕密度マップを、高分解能のX線結晶構造解析における位相問題を解く初期モデルとして利用可能になってきた。
  • 香港大学と中国生物物理研究所の研究チームは、今回、クライオ電顕由来データとX線結晶構造解析由来データを組み合せた立体構造モデル構築を可能とする自動化ワークフローを開発し(下図左参照)、4種類のケーススタディーでその性能を実証した (下図右参照)。
X-ray cryo-EM 1X-ray cryo-EM 2

1.ヒトとマウスの胚への効率的かつ精密な遺伝子ノックインをTild-CRISPR法を開発して実現
  • [出典] "Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouse and Human Cells" Yao X [..]  Li W, Chen ZJ, Yang H. Dev Cell. 2018 May 21;45(4):526-536.e5.
  • Tild-CRISPRは"targeted integration with linearized dsDNA-CRISPR"に由来する呼称: PCR増幅または酵素で精密に切断したドナー遺伝子を800-bpの長さの一対の相同アームを結合した環状プラスミドをin vitroで開裂リニアなdsDNA (以下、Tildコンストラクト)として送達する。
  • 実証実験:Tildコンストラクトならびに、Cas9 mRNA+sgRNAをマウス接合体にマイクロインジェクションし、ノックインと条件付きノックアウトを実現;in uteroエレクトロポレーションにより、in vivoでのノックインを実現;ヒト3前核受精卵 (3PN)へのマイクロインジェクションでOCT4により効率的なノックイン実現 (割球レベルで21/101, 胚レベルで10/14; これまでのHRを介したゲノム編集ではそれぞれ1/60と1/9);3PNにおけるOCT4とGATA6の同時編集は割球レベルで4/137の効率を実現
  • Tild-CRISPRの機序:マウスES細胞とマウス神経芽細胞腫N2a細胞においてNHEJ阻害剤Scr7とHR阻害剤カフェインの影響を、マウス胚編集におけるNHEJ阻害剤Scr7とNu7026およびカフェインの影響を、解析した結果、Tild-CRISPRはHRとNHEJの双方のパスウエイを介することで高いノックイン効率を実現しているとした。
2.トリパノソーマ (Trypanosoma brucei)の高効率遺伝子編集を実現するテトラサイクリン誘導CRISPR-Cas9技術の開発と精密な塩基編集
  • [出典] "Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes" Rico E, Jeacock L, Kovářová J, Horn D. Sci Rep. 2018 May 21;8(1):7960.
  • トリパノソーマの遺伝子編集に最適化したテトラサイクリン誘導CRISPR-Cas9による (下図Figure 1- a,-d)高効率遺伝子編集と技術を確立;この技術に相同組換え修復用オリゴssDNAテンプレートを組み合わせた精密塩基編集 (下図 Figure 4-a 参照)により、アクアグリセロポリン (AQP2)への変異導入 (AQP2-T791G/L264R) でペンタミジンエフロルニチン耐性を再現
Trypanosoma brucei
3.CRISPR/Cas9によるC12orf35への特異的ノックインによる安定なCHO形質転換株の迅速樹立
  • [出典] "Rapid development of stable transgene CHO cell lines by CRISPR/Cas9-mediated site-specific integration into C12orf35" Zhao, M., Wang, J., Luo, M. et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2018 May 22.
  • CHOは組換えタンパク質発現の哺乳類細胞ホストの定番であるが、ランダム挿入法で必要となる選択の繰り返しを回避することを目的として、部位特異的挿入に適したCHOの転写ホットスポットとして3種類の遺伝子座を評価した結果、C12orf35を標的とすることが、効率とCHOの生存性から最適と判断
4.筋ジストロフィーのモデルとなるウサギを開発
  • [出典] "Development of muscular dystrophy in a CRISPR-engineered mutant rabbit model with frame-disrupting ANO5 mutations" Sui T, Xu L, Lau YS, Liu D, Liu T, Gao Y, Lai L, Han R, Li Z. Cell Death Dis. 2018 May 22;9(6):609.
  • 肢帯型筋ジストロフィー (Limb-girdle muscular dystrophy type 2L: LGMD3L)と三好筋ジストロフィー3 (Miyoshi myopathy type 3: MMD3)は、アノクタミン5 (anoctamin-5: ANO5)変異を病因とするが、ANO5の点変異や小規模なindelsに起因するヒト疾患モデルとして適切なマウス系統が樹立されてこなかった。
  • CRISPR-sgRNAを胚にインジェクションすることでエクソン12またはエクソン13に小規模なindelsを導入しANO5をノックアウトすることで、血清クレアチンキナーゼ濃度上昇、筋壊死、脂肪置換、線維症などの症状を呈するウサギを樹立
5. 見えてきた網膜色素変性症の遺伝子修復療法 
  • [出典]:論文 "Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients" Deng WL [..]  Jin ZB. Stem Cell Reports. 2018 Mar 8.;リサーチハイライト "Gene corrections in sight" Weber C. Nat Cell Biol. 2018 May 21.;
Retinitis Pigmentosa Patients
  • 網膜色素変性症 (Retinitis pigmentosa: RP)の原因となるRPGR遺伝子に異なるフレームシフト変異を帯びている3名の患者由来のiPS細胞を樹立し、網膜色素上皮 (RPE)、さらに、電気生理的性質を備えた3次元網膜オルガノイドへと分化誘導;網膜杆体視細胞に異常が起こり、iPS細胞、RPEおよびオルガノイドで毛様体短縮;RPGR変異修復により、網膜杆体視細胞の構造と電気生理学的特性が正常になり、毛様体も正常へと回復し、遺伝子発現も正常に復した。
6.CRISPRFinderを、CRISPRCasFinderへとアップデート
  • [出典] "CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins" Couvin D [..] Pourcel C. Nucleic Acids Res. 2018 May 22
  • CRISPRアレイとCasタンパク質の同定プログラムCRISPRCasFinder公開 (下図ワークフロー参照;提供Webサイトはこちら)
CRISPRCasFinder
7.ラットとマウスにおけるCRISPRオフターゲット編集の包括的解析
  • [出典] "CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice" Anderson KR [..] Warming S (Genentech, Inc.) Nat Methods. 2018 May 21.
  • "deep-sequencing data from 81 genome-editing projects on mouse and rat genomes at 1,423 predicted off-target sites"
  • 1,423種類のオフターゲット編集予測サイトを対象とするディープシーケンシング・プロジェクトをマウスとラットについて行い、オフターゲット編集サイト32種類を同定;in vivoにおけるeSpCas9(1.1)とSpCas9-HFのオフターゲット編集抑制を確認;単一のsgRNAを使用したマウス胚10個およびそれらの遺伝学的な親の全ゲノムシーケンシングから、43種類のオフターゲット編集サイトを同定したが、そのうち30種類は、イオントレント・シーケンシング・プラットフォームに適合させたtarget-enriched GUIDE-seq (TEG-seq)で予測されたサイトであった。
  • オフターゲット編集による予期せざる表現型の発生を回避するには、偏りのない手法によるオフターゲット編集予測に基づいた上で、G0ファウンダーのAmpliSeqスクリーニングを行うことを推奨。
8.Cas9が誘導するdsDNA切断からの修復現象を単一遺伝子座にて解析:運動速度論、精密さ、修復パスウエイの選択
  • [出典] "Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks" Brinkman EK [..] van Steensel B. Mol Cell 2018 May 24.
  • Cas9が誘導するdsDNAの切断と修復機構による修復の運動測度論を、dsDNAが完全な状態、切断およびindel発生の3状態モデルに基づいて展開;修復に要する時間は遺伝子座に依存 (4種類の遺伝子座について半減期1.4、3.9、8.8そして10.7時間を観測);修復はエラーが起こりやすいC-NHEJとMMEJの双方のパスウエイで進行し、両者のバランスは可変であり、また、放射線損傷の影響を受ける;細胞周期との相関は今回の考慮外
9.CRISPR技術の発展は微生物学者の双肩にかかっている
  • [出典] "[Editorial]CRISPR still needs microbiologists" Nat Microbiol. 2018 May 24.
  • CRSIPR技術は、科学技術のニュースポータルでは日々取り上げられ、一般マスコミでも毎週取り上げられるようになり、大ヒット映画"Rampage"のプロットにも使われるに至った  。しかし、CRISPRの由来やCas9の存在、バクテリア・アーケアとウイルスとの共進化については知る人が少ない。
  • 今日のCRISPRの栄光は微生物学の基礎研究に端を発しており、この10年で膨大なCRISPR論文が発表されてきたが、CRISPR獲得免疫機構についてはまだまだ謎が残っていることを認識しなければならない。例えば、CRISPRスペーサのほとんどの由来が不明であり、多様な微生物がCRISPR-Cas9遺伝子を帯びていないことも謎であり、また、CRISPRシステムに加えて新たな防御機能も発見されている (参照 CRISPRメモ_2018/04/29 - 1. [NEWS & VIEWS] 新たなバクテリアの防衛システム)。
  • こうした謎を明らかにしていく基礎的な微生物学は、CRISPRシステムに基づくツール開発と応用展開に寄与する。また、CRISPRシステム以外の微生物の多様な防御システムからも新たな応用分野が広がるであろう。
  • 微生物のファージに対する防御システムをはじめとして微生物の持つ分子機序に基づく技術開発は、近年のCRISPR技術の発展において語られることのなかった微生物学者 (The unsung heroes of CRISPR 参照)による基礎研究から生まれてくる。このため、微生物学分野における人材の育成・確保と継続的な研究資金が求められ、CRISPR特許のライセンシングがもたらす膨大な資金の多くが基礎研究に投じられるべきである。

出典 
  • "Enhanced efficacy of combined temozolomide and bromodomain inhibitor therapy for gliomas using targeted nanoparticles" Lam FC [..] Floyd SR, Hammond PT. Nat Commun. 2018 May 18;9(1):1991.
概要
  • グリオブラストーマ (glioblastoma: GMB)の効果的治療には、血液脳関門 (BBB)や腫瘍微小環境を越えて腫瘍へ薬剤を効率的に送達する手法と、単剤療法への耐性に対抗する手段が必要である。MITとデューク大学の共同研究チームは今回、リポソームをトランスフェリン (transferrin)で機能化したナノ粒子 (transferrin-functionalized nanoparticle: Tf-NP)を開発し、2種類のGMBモデルマウス (ヒトグリオーマU87MG細胞株またはマウスグリオーマGL261細胞株の頭蓋内移植マウス)において、Tf-NPsがBBBを越えて頭蓋内の腫瘍に直接結合することを実証した。
  • GMBに対する抗癌剤テモゾロミド(TMZ)とブロモドメイン阻害剤JQ1の二剤をTf-NPsを介して投与したGMBモデルマウスでは、DNA損傷と細胞死が亢進し、腫瘍量が1.5から2分の1へと縮減し、偽薬投与マウスに比べて延命効果が見られた。また、免疫応答性を備えているモデルマウスへの投与において、Tf-NPs-GMB薬は全身毒性を示さなかった。
Tf-NPs 
  • ペグ化リポソーム・ナノ粒子を抗癌剤送達の担体として利用する手法はDoxil®など、すでにFDAで認可されている。
  • 研究チームは先行研究 (Sci Signal, 2014)で、Doxil®と同様なPEG化リポソーム粒子であるが、同一リポソームのエンベロープ内と水溶性コア内にそれぞれ疎水性エルロチニブと親水性ドキソルビシンを格納し、リポソーム表面を葉酸 (folate)で修飾することで、二剤を葉酸受容体を発現している腫瘍細胞へと選択的に送達するナノ粒子を開発し、ヒト乳癌細胞株BT-20とヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株A549のin vitroおよびそれらの移植マウスモデルin vivoにおいてその抗腫瘍性を実証していた。
  • 研究チームは今回、リポソーム表面を、脳毛細血管内皮とグリオーマ細胞の表面に発現している受容体に結合するリガンドの一種であるトランスフェリンで修飾することで、トランスサイトーシスを介してBBBを越えた薬剤送達を実現した (下図Fig. 4とFig. 1参照、図ではリポソームを長いPEG5000を介してtransferrinで、短いPEG2000介して可視化用蛍光色素Cy5.5で修飾)。
Fig. 4 &1 Table 2
  • さらにTf-NPによるJQ1とTMZそれぞれの単剤投与に比べて2剤送達が相乗的作用で最も効果的に腫瘍を縮減することを見出した(上図 Table 2の右端のカラム; 99.1
    %と99.3%に相当)。

出典とポイント
  • [論文] "An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health" Mimee M, Nadeau P [..] Chandrakasan AP, Lu TK. Science. 2018 May 25;360(6391):915-918.
  • [PERSPECTIVE] "Illuminating dark depths" Gibson PR, Burgell RE. Science. 2018 May 25;360(6391):856-857.
  • YouTube (1m57sビデオ) "The ingestible bacterial-electronic sensor"
  • MITのTimothy K. Luとらは今回、摂取可能なマイクロ・バイオ・エレクトロニック・デバイス (ingestible micro-bio-electronic device: IMBED)を開発し、in vitroおよびin vivoでのヘム検出に加えて、消化管炎症のマーカとなり得るチオ硫酸塩や病原菌感染のマーカとなりえるN-アシル-L-ホモセリンラクトン (AHL) 検出を実現した。
バイオセンサー
  • Escherichia coli O157:H7由来外膜ヘムチャンネル ChuA、Lactococcus lactis由来ヘム応答性転写抑制因子HrtR、およびPhotorhabdus luminescens由来luxCDABEオペロンで構成した遺伝子回路を、E. coli (MG1655 V1)に組み込み、搬送性膜を通してカプセル内に浸み込んでくるヘムを感知して発光する (原論文 Fig. 1 Probiotic E. coli can be engineered to sense blood in vitro and in vivo)
マイクロエレクトロニクスとの融合
  • バイオセンサーからの光に応答するフォトトランジスター、データ処理するマイクロプロセッサー、体外へ信号を送出するワイアレストランスミッターを主要部品とし、容量5 mAhのバッテリーを内蔵して、消化管の環境内で1.5ヶ月間連続使用可能 (原論文 Fig.2 Design and in vitro evaluation of IMBED for miniaturized wireless sensing with cellular biosensors. )
In vivo実験
  • In vitroでは、32.5 ppmの血液検出を実現
  • ブタの胃に直接カプセルを送り込み、外部から付加した0.25 mlの血液によるシグナルの変化を2時間にわたり、ラップトップコンピュータまたはアンドロイド・スマートフォンで解析;52分後からヘム検出し、120分でフォトカレントが5倍に;ヘムトランスポータChuAまたはルシフェラーゼオペロンを欠いた遺伝子回路を組み込んだバイオセンサーからはシグナル無し (原論文 Fig.3 IMBEDs can rapidly detect porcine gastric bleeding )。
評価と展望
  • これまでのカプセル内視鏡と同様に、対象器官の洗浄が不要であり生理条件下での測定が可能であり、器官の構造に加えて、ヒト組織由来の生体分子および体内微生物とその産物の測定も可能に
  • 今回のプロトタイプはバイオセンサー4セットを組み込んだが、チャネルの追加により、冗長な測定による精度向上や、バイオセンサーの開発による異なる生体分子の多重測定が可能に
  • カプセルの位置決技術の改良開発、カプセルのより一層の小型化、バイオセンサーの長寿命化などによる多用途化

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