2018年06月

1.[レビュー] CRISPR技術によるシアノバクテリアの代謝工学
  • [出典] "CRISPR-Based Technologies for Metabolic Engineering in Cyanobacteria" Behler J, Vijay D, Hess WR, Akhtar MK. Trends Biotechnol 2018 Jun 21.
  • CRISPR/Cas9とCRISPR/Cas12aによって、シアノバクテリアの遺伝子置換、マーカーレス点変異、および遺伝子ノックアウトとノックインの多重化が効率的に実現された;CRISPRiによる内在遺伝子の発現抑制により、競合パスウエイのフラックスを低減して目的とする化合物産生へとフラックスを向けることも実現された。
2.CRISPR-Cas9のエレクトロポレーションによるRalstonia eutropha H16のゲノム編集
  • [出典] "Genome editing of Ralstonia eutropha using an electroporation-based CRISPR-Cas9 technique" Xiong B, Li Z, Liu L, Zhao D, Zhang X2,3, Bi C. Biotechnol Biofuels. 2018 Jun 20.
  • Ralstonia eutropha H16水素細菌の一種であり、バイオプラスチックの産生や遺伝子組み換えによるブタノール産生などで関心を集めている。
  • CRISPR-Cas9のR. eutrophaへのCRISPR-Cas9のエレクトロポレーションが制限修飾(restriction-modifcation:RM)系による制約を受けることを見出した。
  • REBASEの参照およびE. Coli MG1655との比較からRM系に関与する5種の制限酵素遺伝子を推定し、そのノックアウト実験を行い、H16_A0006H16_A0008-9のノックアウトによりエレクトロポレーションの効率がそれぞれ1,658倍と4倍へと向上することを見出した。
  • また、果糖によりアラビノース誘導性BADプロモーターのリーキーな発現を抑制することでcas9発現を最適化し、相同組換えを介した遺伝子編集を実現し、5種類の遺伝子の編集を78.3~100%の効率で実現した。
  • CRISPR-Cpf1とNHEJを介した遺伝子編集は実現しなかった。
3.[レビュー]CRISPR-Casシステムによるファージ遺伝子工学
  • [出典] "Phage Genetic Engineering Using CRISPR⁻Cas Systems" Hatoum-Aslan A. Viruses. 2018 Jun 19.
  • ファージ遺伝子のほとんどの機能が未解明である;CRISPR-Casによるファージ・ゲノム工学 (タイプI (Cas3)、Ⅱ (Cas9)、Ⅲ (Cas10);研究事例をまとめたテーブルあり (Table 1)
4.[レビュー] TALENsやCRISPR/Cas9を利用した新育種技術によるジャガイモの品種改良
  • [出典] "Applications of New Breeding Technologies for Potato Improvement" Hameed A, Zaidi SS, Shakir S, Mansoor S. Front Plant Sci 2018 Jun 29.
  • TALENやCRISPR/Cas9を利用した外来遺伝子を含まず精密、迅速かつ効率的な遺伝子編集が可能になり、また、ジャガイモのゲノムが解明され、効率的な形質転換技術が開発されたことによって、ジャガイモの遺伝子工学が大きく進展した(下図は、レビューから引用したFig.1)。
Potato NBT
  • ジャガイモの生産性と品質に対する制約;栄養素含有量の増量;栄養阻害物質・毒素の抑制;新たな育種技術;GMジャガイモの商品化 (リスク評価と規制、一覧表あり)
5.CRISPR/Cas9システムのヤマノイモDioscorea zingiberensisへの展開
  • [出典] "Application of the CRISPR/Cas9 system in Dioscorea zingiberensis" Feng S, Song W, Fu R et al. Plant Cell Tiss Organ Cult 2018 Jun 23.
  • D. zingiberensisは、ステロイドホルモンの出発物質であるジオスゲニンを産生する薬用植物である。武漢大学の研究チームはアグロバクテリウム形質転換法を介したCRISPR/Cas9により、D. zingiberensisのゲノム編集を初めて実現した。

1.CRISPR/Cas9システムが、カチオン性ナノエマルジョンおよびリポソームの物理化学的特性に与える影響
  • [出典] "Physicochemical properties of cationic nanoemulsions and liposomes obtained by microfluidization complexed with a single plasmid or along with an oligonucleotide: implications for CRISPR/Cas technology" Schuh RS, Poletto E, Fachel FNS, Matte U, Baldo G, Teixeira HF. J Colloid Interface Sci 2018 Jun 22.
  • 顕微溶液化によりリポソームDOPE, DOTAP, DSPE-PEG、および、ナノエマルジョンMCTを作出して検証し、CRISPRシステムの結合がドロップレットのサイズ、多分散性指数およびゼータ電位に影響を与えないことを確認;ヒト線維芽細胞、Hep-G2およびHEK-293への導入効率それぞれ25%, 15%, 32%
2.[レビュー]Cas13タンパク質を含むタイプⅥCRISPR-CasシステムによるRNA編集の分子機構
  • [出典] "Molecular Mechanisms of RNA-Targeting by Cas13-containing Type VI CRISPR-Cas Systems" O'Connell M. J Mol Biol. 2018 Jun 22.
  • タイプⅥ CRISPR-Casシステムの発見、多様性(4種類のサブタイプ:A, C, D, B1/B2)および分布 ;Cas13遺伝子 (cas13a, c, d, b)の構成;タイプⅥ crRNAの構造;Cas13のcrRNA反復配列認識機構;Cas13aのcrRNA前駆体の成熟化機構;Cas13の標的RNA探索機構;標的RNAとcrRNAの二重鎖の形成とCas13とcrRNAのコンフォメーション変化;プロトスペーサー結合配列 (Protospacer Flanking Site: PFS);HEPNドメインの保存、コンフォメーション変化およびコラテラルRNA切断;Cas13の標的RNAへの結合と特異的切断の機構;Cas13のヌクレアーゼ活性を調節するタイプⅥアクセサリ・タンパク質モジュール;Cas13 RNA編集のバイオテクノロジおよび医療への応用;今後の展望
3.sgRNAとドナーDNAをコードした直鎖化dsDNAを送達することで、CRISPR/Cas9システムによる1塩基変異を生成
  • [出典] "Straightforward Delivery of Linearized Double-stranded DNA Encoding sgRNA and Donor DNA for the Generation of Single Nucleotide Variants Based on the CRISPR/Cas9 System" Jun S, Lim H, Jang H, Lee W, Ahn J, Lee JH, Bang D. ACS Synth Biol. 2018 Jun 20.
  • ドナーテンプレートとなる一本鎖オリゴヌクレオチドとgRNAをコードしたプラスミドをそれぞれ送達する手法に変えて、双方を直鎖化dsDNAにコードして送達する"sg-DNA"システムを開発し、クローニング不要で、多重な1塩基生成をE. coliおよびヒト細胞で実現
4.プール型CRISPRライブラリーのカスマイズ
  • [出典] "CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries" Kweon J, Kim DE, Jang AH, Kim Y. PLoS One. 2018 Jun 20.
  • 様々な研究グループが開発したハイスループット機能ゲノミクスに利用可能なプール型CRISPRライブラリーを、Addgeneから実費で入手可能であるが、利用者はそれぞれの研究目的に合わせてライブラリーをカスタマイズする必要があり、それには、かなりの時間、作業および経費がかかる。韓国の研究チームは今回、Cas9 RNPsを利用してコンベンショナルなライブラリーを簡便にカスタマイズする手法を開発した。
  • プール型CRISPRライブラリーがU6プロモーターで発現され、プロモーターにはgRNAをコードする領域上流に5'-CCG-3'配列を帯びていることから、これをPAMとして利用することで、プール型CRISPRライブラリーのメンバであるgRNAに対して逆相補的gRNAs (reverse-complementary gRNAs: rc-gRNAs)を設計する。このrc-gRNAsによって、オリジナルのライブラリーから特定のgRNAを欠損させることを可能にした (原論文 Fig.1 を引用した下図参照)。
rc-gRNA
  • 単一遺伝子を標的とする検証に加えて、プール型CRISPRライブラリーからCas9とrc-gRNAのRNPにより、FDA承認薬に関連する27種類のキナーゼ遺伝子を標的とする81種類のgRNAsを同時に除去したカスタム化ライブラリーによるハイスループット・スクリーニングが可能なことも実証した。
5.CRISPRによる生細胞におけるクロマチン凝縮ダイナミクスの可視化
  • [出典] "Live-cell imaging of chromatin condensation dynamics by CRISPR" Xue Y, Acar M. iScience 2018 Jun 5.
  • 酵母の1生細胞において、リボソームDNA (rDNA) クロマチン構造のグルコース飢餓状態における動態を、TET-dCas9-GFPにリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)および18S rDNAを標的とする9種類のgRNAsを組み合わせたシステムによる可視化を介してタイムラプス顕微鏡で観察し、グルコース飢餓がトリガーとなって、rDNAが2段階 (リラックス状態からループまたはリング構造へ、続いて、捩じれながらさらにコンパクトなクラスターへ)で急速に凝縮することを見出した。
  • また、グルコース飢餓に起因する効率的rDNA凝縮には、コヒーシン複合体ではなくコンデンシン複合体が必要であることが明らかになった。
  • さらに、rDNAに結合したdCas9が発現している細胞の生存にDNAヘリカーゼSgs1が必須であることを見出した。すなわち、dCas9が結合した部位におけるDNA複製へのヘリカーゼの関与が示唆された。
6.網膜疾患のCRISPR/Cas9療法の評価
  • [出典] "Application of genome engineering for treatment of retinal diseases" Jo DH, Kim JH. BMB Rep. 2018 Jun 20.
  • 治療用ゲノム編集システムを硝子体内注射または網膜下腔への注入などにより眼球組織局所的に処方することは容易になった;CRISPRのRNPによる送達とウイルスによる送達;Campylobacter jejuni由来Cas9とLbCpf1;VegfaまたはHif1αを標的とするLbCpf1は、眼球組織おける当該遺伝子発現を阻害し、脈絡膜血管新生を抑制し、オフターゲットは非検出。
 CjCas9関連crip_bio記事
  • CRISPRメモ_2018/04/04 - 1. フレームシフト変異に起因するジストロフィン欠損マウスの機能をCampylobacter jejuni Cas9で回復
  • CRISPRメモ_2018/01/07 - 1. タイプ II-A SauCas9とタイプ II-C CjeCas9は、ssRNAも切断する
7.CRISPR/dCas9を介したエピゲノム編集により、デスモプラキン (DSP)発現抑制
  • [出典] "Reversing Mechanoinductive Desmoplakin (DSP) Expression by CRISPR/dCas9-Mediated Epigenome Editing" Qu J, Zhu L, Zhou Z, Chen P, Liu S, Locy ML, Thannickal VJ, Zhou Y. Am J Respir Crit Care Med. 2018 Jun 20.
  • 特発性肺線維症  https://ja.wikipedia.org/wiki/特発性肺線維症 (IPF) で発現が亢進しているデスモプラキン (DSP)の発現を、CRISPR/dCas9によるDNAメチル化酵素Dnmt3Aの活性化により抑制
8.[コメント]NIHの体細胞ゲノム編集プログラムについて
  • [Comment]Genome editing to 're-write' wrongs. Perry ME, Valdes KM, Wilder E, Austin CP, Brooks PJ. Nat Rev Drug Discov. 2018 Jun 22.
  • より安全でより効果的のゲノム編集療法の研究開発の促進を目指して、NIHが開始したSomatic Cell Genome Editing (SCGE)プログラムに対するコメント

1.[技術展望]多能性幹細胞からの細胞系譜解析のルネサンス
  • [出典] Technology Feature "Stem cells: lineage tracing lets single cells talk about their past" Marx V. Nat Methods. 2018 May 31.
  • 受精卵から成体に至るまでの細胞の系譜を解明する技術は、ジョン・サルストンが顕微鏡観察による線虫の全細胞系譜の解明 (fate mapping)以後、酵素の利用、蛍光タンパク質タグの遺伝的導入、細胞のバーコンディングなどの技術によって発展してきたが、近年、ルネサンスが進行しつつある。細胞系譜を追跡する上で目印となるゲノム変化を、CRISPR-Cas9やCre-loxP部位特異的組換えによって生成し、一細胞RNA/DNAシーケンシングによって、各細胞の広範かつ多様な目印を読み分けることで、1回の実験で多数の細胞系譜を追跡することが可能になった。
  • 2018年4月12日のcrisp_bio記事「細胞バーコーディングとscRNA-seqを一体化して、細胞型の同定と細胞系譜再構築の一石二鳥を実現」で紹介した、LINNAEUS (LINeage tracing by Nuclease-Activated Editing of Ubiquitous Sequences)、ScarTrace (CRISPR-Cas9によるDSB修復のscar'傷跡'を利用)そしてscGESTALT (Single-Cell RNA sequencing & Genome Editing of Synthetic Target Arrest for Lineage Tracing) に続き、COLBERT* (COntrol of Lineages by Barcode-Enabled Recombinant Transcription)、CellTagiing**、homing CRISPR system***が取り上げられている。
  • また、10種類のloxPサイトを9種類のシロイヌナズナ遺伝子由来のユニークな178塩基長配列で繋げたカセットをRosa26遺伝子座に組み込んだ人工DNA組換えサイトPolylox****によるマウスの造血幹細胞の系譜解析の事例も取り上げられている。
  参考文献
  • * COLBERT:"Control of lineage-specific gene expression by functionalized gRNA barcodes" Al'Khafaji A, Brock A. bioRxiv 2017 Aug 21.
  • ** CellTagging:"Single-cell analysis of clonal dynamics in direct lineage reprogramming: a combinatorial indexing method for lineage tracing" Biddy BA, Waye SE, Sun T, Morris SA. bioRxiv 2017 Apr 28.
  • *** homing CRISPR system:"Rapidly evolving homing CRISPR barcodes" Kalhor R, Mali P, Church GM. Nat Methods. 2017 Feb;14(2):195-200.
  • **** Polylox:"Polylox barcoding reveals haematopoietic stem cell fates realized in vivo" Pei W, Feyerabend TB [..] Höfer T, Rodewald HR. Nature. 2017 Aug 24;548(7668):456-460.
2.プール型CRISPRiによるバクテリアのゲノムワイド機能ゲノミクス
  • [出典] "Pooled CRISPR interference screening enables genome-scale functional genomics study in bacteria with superior performance" Wang T, Guan C, Guo J, Liu B, Wu Y, Xie Z, Zhang C, Xing XH. Nature Commun. 2018 June 26.
  • 精華大学とSyngenTechの研究チームは今回、プール型CRISPRi を利用して、各遺伝子の転写抑制が細胞の表現型に与える作用を測定することで、バクテリアの遺伝子と表現型の相関をゲノムワイドで同定するためのハイスループットスクリーニング実験のプラットフォームを開発し (原論文Fig.1を引用した下図参照)、E. coliの機能ゲノミクスで検証した。
CRISPRi pooled screening
  • 研究チームは始めに、タイリング・スクリーニングによって、真核生物ゲノム独特の構造に適合したgRNAライブラリーを設計するルールを同定し、E. coliゲノム全域を標的可能なgRNAライブラリー (~60,000メンバ)を構築し、E. coliの機能ゲノミクスを進めた。
  • プール型CRISPRiは、ライブラリーのサイズが同程度または遺伝子の長さが短い場合は、微生物機能ゲノミクスの標準的手法とされているトランスポゾン・シーケンシング (transposon sequencing : Tn-seq)に優ることを示した。
  • プール型CRISPRiによって、遺伝子の必須性、表現型のノン・コーディングRNAs (ncRNAs)へのマッピング、代謝経路解析、化学毒性耐性遺伝子の同定を実現。
3.E. coliに最適なCRISPRaを開発し、バクテリアの転写をリプログラミング
  • [出典] "Synthetic CRISPR-Cas gene activators for transcriptional reprogramming in bacteria" Dong C, Fontana J, Patel A, Carothers JM, Zalatan JG. Nat Commun 2018 June 27.
  • ワシントン大学シアトルの研究チームは今回、E. coliにおいて、CRISPR-dCas9システムを介して遺伝子の発現を最も活性化するタンパク質SoxSを同定することで、E. coliでも有効なCRISPRaシステムを構築した(原論文 Fig.1 を引用した下図参照)。
CRISPRa for E.coli
  • SoxSはRNAポリメラーゼにおいて保存性が高い部位と相互作用することから、今回E. coliで高性能を実証したCRISPRaは他の微生物へ展開可能である。
  • このCRISPRaはCRISPRiと併用可能であり、すなわち、特定の遺伝子の発現活性化とそれと異なる遺伝子の発現抑制を同時に実現可能なことを示した。さらに、このCRISPRaによって、異種エタノール生合成パスウエイからの生産量向上を実現した。
  • 今回、E. coliの遺伝子発現活性化が、gRNAの標的サイトの位置に極めて高い感受性を示すことも見出した。
  • [2018-10-18追記] Author Correction: Synthetic CRISPR-Cas gene activators for transcriptional reprogramming in bacteria.  "Supplementary Information file associated with this Article, the sequence ‘1x MS2 scRNA.b2’ was incorrectly given ......" Nat Commun. 2018 Oct 15
4.CRISPR-goldによりRNPを脆弱X症候群マウスモデルの頭蓋内へ注入することで、マウスモデルの異常な反復行動を抑制
  • [出典] "Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours" Lee B, Lee K, Panda S, Gonzales-Rojas R, Chong A, Bugay V, Park HM, Brenner R, Murthy N,  Lee HY.  Nat Biomed Eng. 2018 June 25.
  • UT Health Science Center、UC BerkeleyおよびGenEditの研究チームは、金のナノ粒子によってCas9またはCpf1とsgRNAのRNPを脆弱X症候群マウスモデルの脳内へ注入し、神経細胞、アストロサイトおよびミクログリアを含む主要な細胞型において遺伝子編集が可能であり、かつ、実験で使用した用量内では細胞毒性が見られないことを示した。
  • CRISPR-goldは、金ナノ粒子の表面を大量のDNAオリゴヌクレオチド鎖で覆い、続いて、Cas9またはCpf1とgRNAのRNPで修飾した粒子をポリマーで被覆したものである。
  • また、代謝型グルタミン酸受容体5 (mGluR5)を標的とするCRISPR-goldによって線条体に注入すると、mGluR5のレベルが線条体局所的に低下し、脆弱X症候群マウスモデルに見られる自閉スペクトラム障害の典型的行動の一種である過剰な反復行動を30%〜70%低減した。
  金ナノ粒子crisp_bio関連記事

  • 医学生物学研究資源の代表である遺伝子・ゲノムデータについては, DDBJ, NCBIおよびEMBL-EBIが共同で構築・提供しているINSDC(International Nucleotide Sequence Database Collaboration)に蓄積され広く利用される制度そして研究文化が確立しています。
  • 微生物学の世界では古くから、命名の根拠となった標準株をはじめとして研究開発に利用された菌株を微生物系統保存機関 (culture collections: CC)に寄託し、研究社会で共有する制度と文化が醸成されていました。そのルーツは、1890年(*crisp_bio注: 2018/7/15日に'1980年代'から修正)のチェコスロバキアにまでたどることができ、米国ATCC、オランダCBS、英国IMIもそれぞれ1911年、1903年、1920年にはすでにその前身が設立されていました。
  • いずれの国においても研究基盤事業であるCCsには紆余曲折がありましたが、現在では、World Data Center for Microorganisms (WDCM)のディレクトリーに75カ国から755 CCsが登録されるに至っています。
  • WDCMは、オーストラリアの微生物分類学者V. B. D. Skermanが1966年に、当時の国際的研究コミュニティーやUNESCOなどの支援のもとに設立し、1986年から理化学研究所、その後、国立遺伝学研究所を経て、2010年から中国科学院微生物学研究所 (Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science : IM-CAS)で運営されているデータセンターです(下図 WDCMホームページ参照)。
WDCM
  • WDCMは2010年以後 (参考文献1)、ディレクトリーに加えて、46カ国120 CCsで維持されているのべ40万株を超えるカタログの統合データベースGlobal Catalogue of Microorganisms(GCM, 下図左Webページ参照)、菌株ごとの研究論文および特許における引用・利用分析データベースAnalyzer of Bio-resource Citations (ABC, 下図右Webページ参照)を開発・提供してきました。
GCM ABC
  • WDCMではデータベース中に菌株に関連する配列データへのリンクを付していましたが、2017年にバクテリア・アーケアを中心に菌類も対象とする当初5年計画の「標準株10K (1万)株全ゲノムシーケンシング (WGS)プロジェクト」を企画し、中国および国際的な事前評価を経て、2018年からGCM2.0として始動しました (参考文献 2, 3)。
  • GCM2.0は、米国JGIのGEBAプロジェクトおよびFungal 1000ゲノムプロジェクトを始めとして、国際的なマイクロバイオームプロジェクトや、Global Genome Biodiversity Network (GGBN)、Earth BioGenome Projectと協調しながら進めて行こうとしています。
  • GCM2.0の目標株数である10K株は、既知の標準株のうちJGIなどによるWGSが公開あるいは着手予定のない株数と、今後5年間の間IJSEM誌上でで公式な命名として認められるであろう新規標準株の数から算定したものです。
  • 今回、15カ国24CCsから菌株または抽出DNAの提供を得られる見込みがついたことから、2018年6月25日から26日にかけて北京にてGCM 2.0 SIGs (Special Interests Groups)会合開催に至りました。今回の会合はGCM2.0に連携するCC、ジャーナル、データベース、プロジェクトなどの関係者が集まったクローズドな会合でしたが、今後、折に触れて公開ワークショップやシンポジウムが開催される見込みです。GCM2.0の成果であるWGSおよびアノテーションは、国際的かつ広く一般に公開されます
  • GCM2.0の動向をフォローしたい、特定の標準株のWGSを推奨したい、GCM2.0にSIGを提案したいなど、さまざまなご関心をお持ちの場合は、どうぞコメントをお寄せください。GCM2.0用コミュニーケションツール検討の参考にもさせていただきます。
 参考文献
  1. "World data centre for microorganisms: an information infrastructure to explore and utilize preserved microbial strains worldwide" Wu L. et al. Nucleic Acids Res. 2017 Jan 4;45(D1):D611-D618.
  2. "The Global Catalogue of Microorganisms 10K type strain sequencing project: closing the genomic gaps for the validly published prokaryotic and fungi species" Wu L. et al. Gigascience. 2018 May 1;7(5).
  3. "New effort to sequence microbes" Science (in News at a glance)  30 Mar 2018:Vol. 359, Issue 6383, pp. 1444-1446
(文責 crisp_bio/GCM2.0関係者)

  • [出典] "Efficient single-copy HDR by 5' modified long dsDNA donors" Gutierrez-Triana JA, Thumberger T, Tavhelidse T [..] Wittbrodt J. bioRxiv 2018-06-22
  • CRISPR/Cas9は、DSBのNHEJ修復機構を介してゲノム上の標的部位への効率的変異誘発を可能にしたが、遺伝子の修復、置換あるいはタギングなどのゲノム編集には、細胞周期のS/G2期後半で活性が上がって来るDSB修復機構HDRを介した内在DNA断片の精密な編集が必須である。これまで、NHEJに対してHDRを亢進するために、酵素によるNHEJの抑制、Cas9の改変によるHDRの亢進など様々な手法が提案されてきた。
  • HDRによるゲノム編集では、CRISPR/Cas9に加えて、標的の遺伝子座に相同な隣接領域を帯びた修復用DNAドナーを使用することで、特定の変異やDNA配列を挿入する。HDRと並存しているNHEJは高活性であり、CRISPR/Cas9を介した標的DNA部位の切断を再結合するとともに、直鎖状dsDNAドナーテンプレートの多量体化をもたらすことから、シングルコピーのドナーテンプレートに基づくHDRは極めて稀になる。しかし、この多量化の問題への取り組みはなされていなかった。
  • ハイデルベルグ大学の研究チームは今回メダカにおいて、内在するDNA修復機構に干渉することなく、修復用の長いdsDNAの双方の5'末端をバルキーな分子で修飾することにより、ドナーをNHEJと多量体化から保護可能なことを示した。
  • メダカの一細胞期胚において、ビオチンとSpC3で修飾したドナーは6時間後も単量体に止まった一方で、修飾しなかったドナーは2時間後にはすでに多量体化することを、見出した。続いて、ビオチン修飾ドナーを使用することで、in vivoでGFP配列1コピーのノックインを60%の効率で達成した。
 参考資料:

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