2018年07月

1. [News & Views]Cas9はオンターゲットに想定外の損傷を与える
2. バイスタンダー活性とオフターゲット活性を最小限にとどめたAPOBEC3A-Cas9による1塩基編集(BE)
  • [出典]"An APOBEC3A-Cas9 base editor with minimized bystander and off-target activities" Gehrke JM, Cervantes O, Clement MK, Wu Y, Zeng J, Bauer DE, Pinello L, Joung JK. Nat Biotechnol. 2018 Jul 30.
  • CRISPR-Cas9を利用してシチジンデアミナーゼの活性を特定の遺伝子座に作用させるBEは、シチジンからチミジン(C-to-T)への精密変換を実現し、BEの拡充と応用が進んでいる。しかし、BEは、シチジンデアミナーゼの編集対象領域(5塩基対ウインドウ)内に1つ以上のCが存在する場合は、想定外のC-to-T置換が発生するバイスタンダー置換の問題を抱えていた。
  • J Keith Joungらの研究チームは今回、ラット由来のAPOBEC1に替えて、変異導入によりヒトAPOBEC3A(A3A)から最適化したシチジンデアミナーゼ (eA3A)を利用することで、特定の配列モチーフ内のCを優先的に脱アミノ化する手法eA3A-BE3を実現した。具体的には、3種類のモチーフの中で、VCN<TCY<TCRの順に脱アミノ化の優先順位が高くなる。
  • ヒト細胞においてBE3とeA3A-BE3による編集を比較し、TCモチーフ内のCの置換活性は同等であったがその他の配列中のCの置換がeA3A-BE3で大きく低減することを見出した。βサラセミアにおけるプロモーター変異の修復精度で比較すると、eA3A-BE3はBE3の40倍を超える精度を実現した。オフターゲット編集もまた、eA3A-BE3で低減した。
  • eA3A-BE3は、モチーフの縛りがあることでゲノム上の標的可能領域が狭められる弱点があるが、多様なBEの併用により結果的に解決すると見ている。
  • 関連crisp_bio記事:2017-09-05 塩基編集法(BE)第4世代へ:BE1, BE2, BE3からBE4へ - 望ましくない変換の発生とその原因究明
  • [注]bioRxiv投稿分をcrisp_bio記事「CRISPRメモ_2018/03/03 5.ヒトAPOBEC3Aの利用による高精度CRISPR-Cas9塩基編集 (BE)法を開発:バイスタンダー変異とオフターゲット変異を最小限に留めた」にて紹介
3. タイプIII CRISPRのセカンドメッセンジャーを介したウイルスRNAの非選択分解のオフ・スイッチを同定
  • [出典]"Ring nucleases deactivate Type III CRISPR ribonucleases by degrading cyclic oligoadenylate" Athukoralage JS, Rouillon C, Graham S, Grueschow S, White MF. bioRxiv 2018 Jul 30; Nature. 2018 Oct 11;562(7726):277-280. Online 2018-09-19.
  • タイプⅢ CRISPRシステムは、Cas10とCsm2/3/4/5の複合体によるウイルスDNAの非選択的切断とDNAから転写されたRNAのcrRNA依存選択的切断に加えて、セカンドメッセンジャーを介したウイルスRNAの非選択的分解の機構を備えている。すなわち、標的RNAの結合によって活性化したCas10のサブユニットPALM/cyclaseドメインがATPからサイクリックオリゴアデニル酸(cOA)を合成し、このcOAがセカンドメッセンジャーとしてCsm6のCARF (CRISPR associated Rossman Fold)ドメインに結合することで、Csm6/Csx1によるウイルスRNAの非選択的切断が進行する(参照:CRISPRメモ_2017/08/07 3. バクテリアの獲得免疫機構におけるセカンドメッセンジャー発見)。
  • セントアンドリュース大学の研究チームは今回、Sulfolobus solfataricus をモデルとして、cOAを介したRNAの非選択的切断パスウエイのオフ・スイッチの存在と機構を明らかにした。ウイルスRNAの分解が完了するとcOAの合成が止まるが、それまでに合成されたcOAを分解し、このパスウエイを終結させるヌクレアーゼを同定し'RING nucleases'と命名した (下図中央 参照)。
cOA
  • 関連crisp_bio記事:CRISPRメモ_2018/05/09-1 1. Staphylococcus epidermidis由来Csm3とCsm6のリボヌクレアーゼ活性の構造基盤;CRISPRメモ_2017/08/07 3. バクテリアの獲得免疫機構におけるセカンドメッセンジャー発見
4. コモンマーモセットES細胞ゲノムの全ゲノム・ハプロタイプフェージング解析:ヒト疾患細胞モデル構築の基盤に
  • [出典]"Haplotype-phased Callithrix jacchus embryonic stem cell line for genome editing using CRISPR/Cas9" Zhou B [..] Urban AE. bioRxiv 2018 Jul 30.
  • スタンフォード大学、ウイスコンシン・マディソン大学などの共同研究チームは、ヒト疾患モデルとして有用なコモンマーモセットの胚性幹細胞株(ESC line)cj367(Wisonsin国立霊長類研究センター由来)を対象として、ハプロタイプごとのSNVsとindelsの検出を伴う全ゲノム解析を実行した。
  • 続いて、ハプロタイプ情報に基づいて、cj367ESCにおけるCRISPRのアレル特異的標的サイトのリストを整備した。その上で、多能性を損なうことなくdCas9の発現と標的局在化が可能なことを確認した。また、ESCsを迅速かつ1段階で、機能する神経細胞への分化を誘導可能なことも確認した。

[出典]"FerriTag is a new genetically-encoded inducible tag for correlative light-electron microscopy" Clarke NI, Royle SJ. Nat Commun. 2018 Jul 4;9(1):2604.

背景
  • 同一試料から蛍光顕微鏡と電子顕微鏡とで得られる像を相関解析する光—電子相関顕微鏡法 (Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM*)は、研究対象のタンパク質(Protein of Intrest, POI)の局在を細胞内で高精度で追跡するに有用な手法である。POPI追跡にはこれまで主として免疫金標識 (imminogold labeling)が利用されてきたが、侵襲性であることから、細胞透過過程を必要としない遺伝的に導入可能なPOI標識法に注目が集まっている。
  • *) CLEM解説ビデオ [アニメ] What is Correlative Microscopy? (5m46s)  [操作]A n introduction to on-section CLEM (11m58s)
FerriTag技術
  • 英国Warwick Medical Schoolの研究チームは今回、遺伝的に導入可能であり、ラパマイシンによるヘテロ二量体化を介してPOIに結合可能な高電子密度の組換え蛍光フェリチン粒子タグ、FerriTag、を開発した。試行実験を経て、FerriTagをFRB-mCherry-FTH1およびFTLで構成し、ラパマイシンを介したFRBとFKBPのヘテロ二量体化を介したPOIの間接的標識法を確立した (ここで、FTH1とFTLはそれぞれフェリチン''の重鎖と軽鎖を意味する。
  • 下左図上段 Supplementary Figure 5は、FerriTagとGFP-FKBPを融合したPOI(CD8α)が、ラパマイシンによるFerriTagのFRBと、FKBPのヘテロ二量体化を介して結合した模式図である。
  • 下左図下段 Fig. 1は、クラスリン (LCa)軽鎖をFerriTaggingした模式図である。
  • 下右図 Fig. 5の a はFerriTag-CLEMのワークフローである。
スFerriTag 5-1 FerriTag 2

FerriTag標識の検証
  • 上右図Fig. 5の中段 b-は、ミトコンドリア外膜のタンパク質の一種であるモノアミン酸化酵素 (MAO)と、クラスリンの三脚巴構造(triskelion)の一部であるクラスリン軽鎖(LCa)をPOIとするFerriTag-CLEMで得られた蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の画像である。
  • 下図は、huntingtin-interacting protein 1 related (HIP1R)をPOIとしたCLEMの結果である:クラスリン被覆ピットの内部および周囲における分布を高精度で特定;位置に依存するコンフォメーション変化も同定 。FerriTag 5

[出典]"Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling" Nir G, Farabella I,  Estrada CP, Ebeling CG [..] Stuckey J, Yin P, Lieberman E, Aiden EL, Marti-Renom MA, Wu CT. bioRxiv 2018 Jul 28

解析対象
技術と成果
  • RNA FISHおよびDNA FISHに適した効率の良いオリゴヌクレオチド・プローブを生成する技術Oligopaintsで生成した45,407 ss-oligos、ならびに、Oligopaintsに超解像蛍光顕微鏡Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)およびDNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography (DNA-PAINT) をそれぞれ融合したOligoSTORMとOligoDNA-PAINT技術に基づく単分子局在顕微鏡(Single-molecule localization microscopy: SMLM)法により、細胞ごとに変動する染色体のコンパートメントの識別にも成功した。
  • *) "In Situ Super-Resolution Imaging of Genomic DNA with OligoSTORM and OligoDNA-PAINT" Beliveau BJ, Boettiger AN, Nir G, Bintu B, Yin P, Zhuang X, Wu CT. Methods Mol Biol. 2017;1663:231-252.
  • 続いて、SMLMからの超高解像度画像データにHi-Cのコンタクトマトリックス・データを組み合わせ、研究チームが今回開発したゲノム領域の統合モデリング(integrative modeling of genomic regions, IMGR)の手法を利用した拘束条件付きモデリングにより10 kb分解能で染色体を再構成した。
  • さらに、PGP1ゲノムのハプロタイプは解析済みでありまた家系解析も可能であったことから、母親由来と父親由来のホモログを識別し、染色体構造に差異があることを見出した。
  • 技術資料 (下図Fig. 1参照)
hChr19-1 hChr19-2

[出典]"Dynamic interplay between enhancer–promoter topology and gene activity" Chen H, Levo M, Barinov L, Fujioka M, Jaynes JB, Gregor T. Nat Genet. 2018 Jul 23.
  • [背景1] エンハンサーは発生に必須の遺伝子発現制御に重要な役割を果たしている。ヒトには、ゲノム解析から、20万から100万を超えるエンハンサーが存在するとされている。エンハンサーの多くは、その制御の対象とするプロモーターから遺伝的距離が遠く離れた領域に位置する。ショウジョウバエゲノムのようなコンパクトなゲノムであっても、エンハンサーの少なくとも30%が20 kb以上離れたプロモーターと、その中間に位置する遺伝子群を超えて、相互作用する。
  • [背景2] 複雑で精緻な遺伝子調節の仕組みの中でもこの長距離相互作用が由って来る分子機構は、3世紀にわたる研究を経ても解かれていない課題である。FISHやクロマチン・コンフォメーション・キャプチャ(3C)技術によって、エンハンサーとプロモーターの物理的相互作用を示すデータが蓄積されてきてはいるが、一時的な接触と安定したトポロジーを形成する機構やトポロジーと転写の間の因果関係を解き明かすに必要なダイナミックな相互作用を示すデータは乏しい。
  • プリンストン大とトーマス・ジェファーソン大の研究チームは今回、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術も利用した多色標識により、ショウジョウバエ胚の発生過程in vivo1細胞レベルで、エンハンサーとその標的のプロモーターの位置関係を追跡し、同時に、転写活性もモニター可能とする手法を開発し、遺伝子調節機構について新たな知見を得た。
  • ショウジョウバエのeven-skipped (eve)遺伝子座から上流へ-142 kbの位置にレポーターを配置;この領域には、細胞性胞胚における7本のストライプの発現をドライブする5種類のエンハンサーが存在
  • 三色可視化:[オスのeve遺伝子座の改変] 内在eveエンハンサーにCRISPRゲノム編集によりMS2ステムループ導入;eveの上流-142kbに配置するレポーター・カセットは、eveプロモーターの上流にeve遺伝子座の3'末端に位置する内在homieとの対合による安定なループ形成を誘導するために、368 bpのインスレーターエレメントhomieをセットし、eveプロモーターの下流にPP7ステムループをセット、さらに、転写活性に依存しないマーカ用としてBurkholderia parS DNA配列をセット(parS-homie-evePr-PP7);[蛍光コートタンパク質を発現させたメスとの交配] オスeve遺伝子座改変にそれぞれに対応するMCP-mBFP2 (MS2)、PCP-mKate2 (PP7)、ParB-EGFP (parS)を発現するメスと交配 (原論文 Fig. 1参照);三色タイムラプス共焦点蛍光顕微鏡で観察
  • トポロジカル・コンフォメーション3状態を同定し、状態間の遷移モデルも構築・解析:エンハンサーとプロモーターが離れている状態;インスレーターの対合により両者が接近('within range')しているが、転写が進行していない状態;両者が近接し転写が進行している状態
  • 'hit-and-run'モデルは成立しない:エンハンサーとプロモーターが物理的に接触することで転写が始まり、エンハンサーが遊離すると転写が止まり、転写進行中はエンハンサーとプロモーターが遊離することはない
  • 転写の進行がトポロジカル・コンフォメーションに作用する:インスレーターが対合したトポロジーを安定化し、トポロジーをよりコンパクトにする
  • 共通のエンハンサーでドライブされる内在eveの転写とレポーター遺伝子の転写が競合する:レポーター遺伝子の転写が共存する細胞ではeveの転写が5%-20%低減し、表現型にも影響

1. ヒト細胞のCRISPR-Cas9ゲノム編集に、Fanconi anemiaパスウエイが関与する
  • [出典]"CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway" Richardson CD, Kazane KR, Feng SJ, Zelin E, Bray NL, Schäfer AJ, Floor SN, Corn JE. Nat Genet 2018 Jul 27;"CRISPR-Cas9 genome editing in human cells works via the Fanconi Anemia pathway"bioRxiv 2017-05-09.;[モデル・ビデオ]IGI Paper Delivery: Uncovering a hidden step in CRISPR "cut and paste
  • [背景] CRISPR-Casシステムが誘導するDNA二重鎖切断(DSB)からの修復を利用する遺伝子置換法が急速に広がってきた。この修復は、二重鎖DNA (dsDNA)を修復のドナーとする相同組み換え (homologous recombination: HR)と、合成した一本鎖オリゴDNA (ssDNA)を修復のテンプレートとするsingle-stranded template repair(SSTR)の2種類の相同組換え修復 (Homology Directed Repair: HDR)過程に依存する。
  • 遺伝子置換の効率は、ほとんどの細胞においてdsDNA-HRが低く、SSTRはヒト細胞の20%を超えるアレルに対して高い置換効率を示すが、その分子機構の解明は進んで来なかった。
  • Innovative Genomics Institute/UC Berkeleyの研究チームは今回、数千の遺伝子ノックダウンからの多重な編集結果を解析する"coupled inhibition-cutting"プラットフォームを開発し(原論文 Fig. 1A参照)、ヒト癌細胞をスクリーニングしている過程で、SSTRには、Fanconi anemia (FA)パスウエイに関与する因子群が必須であることを見出した。FAパスウエイは、DNA鎖間架橋修復 (interstrand cross-link (ICL) repair)に関与するとされている。
  • "coupled inhibition-cutting"法は各遺伝子の転写開始点を標的とするプール型sgRNAs (2,000遺伝子を標的とする5 gRNAs/遺伝子)に基づくCRISPRiに、BFPレポーター遺伝子を標的とするCas9 RNPと、BFPをGFPに変換するための3-bpコドン・スワップをもたらすssODNレポーター遺伝子による遺伝子ターゲッティングを組み合わせ、BFP-GFP変換を指標として、編集を加えた細胞集団をFACSで選別し、細胞の亜集合ごとに含まれるgRNAをイルミナでシーケンシングし、編集の有無そしてまたは編集パスウエイと遺伝子の相関を同定する。
  • その結果、FA関連遺伝子群のノックダウンがSSTRを著しく阻害し、さらに、FA遺伝子の阻害実験を介して、FAパスウエイがDSB修復過程としてNHEJに対してSSTRを亢進することを見出した(著者らはFA因子群を'交通信号'に例えている)。
  • FAパスウエイ関連因子の中で、FANCD2タンパク質はCas9に誘導され修復進行中のDSB部位に局在し、ゲノム編集の調節に直接関与することが示唆された。
  • FA自身は遺伝子疾患であり、今回のデータは、遺伝子編集療法の効用が患者の遺伝型そしてまたはトランスクリプトームに依存すること、また、FA修復パスウエイへとシフトさせる手法が遺伝子置換ひいては遺伝子治療に有用なこと、が示唆された。
  • 関連論文 (2018/08/07追記):"FANCA Promotes DNA Double-Strand Break Repair by Catalyzing Single Strand Annealing and Strand Exchange" Benitez A, Liu W, Palovcak A, Wang G, Moon J, An K, Kim A, Zheng K, Zhang Y, Bai F, Mazin AV, Pei XH, Yuan F, Zhang Y. Mol Cell. 2018 Jul 23.
  • 関連crisp_bio記事:2018-7-24 奥が深いCas9によるDSBからのdsDNAの修復結果と修復過程を探る
2. ペアワイズ・ライブラリー・スクリーニングにより、ヒト細胞におけるStaphylococcus aureus Cas9の特異性を探った
  • [出典]"Pairwise library screen systematically interrogates Staphylococcus aureus Cas9 specificity in human cells" Tycko J [..] Wilson CJ, Hsu PD. Nat Commun 2018 Jul 27. (bioRxiv 2018-02-22)
  • 小型のSaCas9をAAVで送達するゲノム編集療法は前臨床試験では成果をあげているがヒトに展開するにはオフターゲット作用の厳密な検証が必要である。
  • Editas Medicineを中心とする研究チームは今回、スペーサー/gRNAと標的配列をペアにし、コンストラクトの品質管理用ランダム化バーコードとペアワイズコンストラクトの同定用誤り訂正ハミング符号用配列を加えたコンストラクト(下図 Fig. 1-a)参照)を、レンチウイルスでHEK293細胞へ送達し、SaCas9のオンターゲットおよびオフターゲットの編集結果を網羅的に検証した(下図 Fig.1-b)参照)。
SaCas9 1
  • 73グループのsgRNAsについて88,692組のsgRNA-標的配列ペアを用意(sgRNA全てについて1塩基ミスマッチと2塩基ミスマッチの標的配列を組み合わせ、一部のsgRNAグループについては一塩基挿入・欠失の標的配列も組み合わせ)
  • オンターゲット効率は21-ntと22-ntのスペーサーが高い
  • ミスマッチへの寛容度は21-ntスペーサーが最も高く、20-ntスペーサーが最も非寛容
  • 今回得た実験データを元に、非線形回帰モデルによるSaCas9の特異性スコアを導出
3. [レビュー]多用途ゲノム工学技術によるゼブラフィッシュにおけるヒト眼疾患研究の進展
  • [出典]"Versatile Genome Engineering Techniques Advance Human Ocular Disease Researches in Zebrafish" Zheng SS, Han RY, Xiang L, Zhuang YY, Jin ZB. Front Cell Dev Biol 2018 Jul 12;6:75.
  • 第3世代アンチセンスとも言われるモルフォリノ(MO)技術による遺伝子ノックダウンによって眼疾患のゲノミクスが進み始めたが、続いて、ZFNsとTALENsによりMOの弱点が克服され、さらに、CRISPR/Cas9によって効率化が進んだ。この技術開発に伴うゼブラフィッシュをモデルとする眼疾患研究の進展(下図 Figure 1参照)をレビューmodeling

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