2018年10月

1. マウス胚において、sgRNAと3塩基ミスマッチのサイトで、高頻度なオフターゲット編集が発生
  • [出典] "CRISPR/Cas9 can mediate high-efficiency off-target mutations in mice in vivo" Aryal NK, Wasylishen AR,  Lozano G. Cell Death & Diseases 2018 Oct 27.
  • Dicer1を標的とするsgRNA, spCas9 mRNAおよび123塩基のssDNAドナーを、200受精卵に導入し、得られた38匹について、オンターゲットとhttp://crispr.mit.edu/による推定オフターゲット部位の1 Kbp領域の配列を解析し、シード領域外でミスマッチが3塩基以下のオフターゲット編集に注意が必要とする結果を提示
  • オンターゲットにて、NHEJによる変異15匹、HDRによる置換2匹;3塩基ミスマッチのオフターゲット (PAMから1, 4および8塩基の位置)への変異誘導11匹 (3匹オンターゲット野生型のまま);4塩基ミスマッチのオフターゲット (PAMから1, 2, 5および8塩基の位置)変異誘導は無し
2. 核酸二重鎖エネルギーからCRISPR-Cas9のオフターゲット編集を評価
[出典] "CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters" Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. Genome Biol. 2018 Oct 26;19(1):177
  • RNA-RNA、DNA-RNAおよびRNA-DNAの二重鎖のエネルギー変数をもとにしたCas9-gRNA-DNA複合体の結合エネルギーモデルに基づいてオフターゲット結合・編集を予測する2種類の手法を開発 (原論文Fig. 1から引用した下図参照):gRNAのオフターゲット・スコアを計算するCRISPRoffとgRNAの特異度を計算するCIRSPRspec
NA duplex energy parameter
3. [データベース] PGED: 植物ゲノム編集データベースへの登録呼びかけ
[出典] "Plant Genome Editing Database (PGED)" http://plantcrispr.org/
  • 米国NSF支援プロジェクト
4. [特許] ERS Genomics, Charpentier/DoudnaのCRISPR/Cas9の第二の米国特許が成立したと発表
[出典] "U.S. Patent office grants second Charpentier/Doudna patent covering CRISPR/Cas9 gene editing" ERS Genomics News. 2018 Oct 30.
  • ERS Genomicsは、「ヒトと動物の細胞を含むあらゆる環境における一重/二重gRNAsの組成を対象とする特許であり、Broad研とUCとの間の特許係争の対象外の特許」としている。
  • 関連crisp_bio記事: CRISPRメモ_2018/08/10 2. CRISPR特許:カリフォルニア大学として初の特許成立
5. [特許] 膨大かつ多様な配列から解析対象とすべき配列抽出を可能とするCRISPR/Casシステム
[出典] US2018/0298421"Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using CRISPR/Cas system proteins"  
  • 公開日:2018-10-18
  • 発明者 : Carpenter ML, Bustamante CD, Hills E. Gourguechon SB.
  • 権利者: Arc Bio LLC
  • ヒト臨床サンプルや高精度そしてまたは高感度なメタゲノムの効率的解析に有用
6. [特許] CRISPR/Casによる相同組み換え修復 (HDR)を介したゲノム編集効率の向上法
  • 発明者:Cotta-Ramusino C.
  • 権利者:EDITAS MEDICINE Inc
  • 公開日:2018-10-18
  • ヒト細胞および動植物・微生物細胞に適用可能

[出典] "CRISPR-Sirius:RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging" Ma H,Tu LC, Naseri A, Chung YC, Grunwald D, Zhang S, Pederson T. Nat Methods. 2018 Oct 30. ("CRISPR-Based DNA Imaging in Living Cells Reveals Cell Cycle-Dependent Chromosome Dynamics" bioRxiv 2017-09-29)
  • 多重MS2アプタマーを利用する蛍光標識法を改良したCRISPR-sgRNA Siriusを開発:sgRNA鎖への八連のRNAアプタマーMS2の挿入位置を最適化;各MS2に変異を導入し、ウイルス形質導入の際の多重MS2のミスフォールディングや組み換えを最小限に (sgRNA-Sirius-8XMS2: 原論文 Supplementary Fig. 3c & Supplementary Fig. 4参照)
  • CRISPRainbowやsgRNA-3′-14XMS2などから性能向上:低コピー数の標的の可視化;ヒトU2OS細胞内で第19染色体上のkilobasesからmegabasesの間隔の標的ペア、ひいては染色体の動態、を可視化
  • Pedersonチーム成果 関連crisp_bio記事:2017-04-29 CRISPR/Cas9で細胞内動態を直接観察

[出典] "Intrinsic Nucleotide Preference of Diversifying Base Editors Guides Antibody Ex Vivo Affinity Maturation" Liu LD, Huang M, Dai P [..]  Zhao Y, Yeap, LS, Meng  FL. Cell Rep. 2018 Oct 23.

背景
  • 塩基編集 (BE)法は、BE3、YEE-BE3、SaBE4-GamおよびTarget-AIDといった精密な塩基編集を目的とするBE (precision BE, PBE)と、CRISPR-XやTAM (Targeted AID-mediated Mutagenesis)*といった局所的に配列を多様化するBE (diversifying BE, DBE)に分類される**。DBEを介して体細胞超変異 (somatic hypermutations, SHM)を誘導することで、高親和性抗体を作出することが可能である。
  • (*) CRISPR関連文献メモ_2016/12/04 2- [NEWS & VIEWS] TAM法とCRISPR-X法:CRISPR-Cas9-AIDによるゲノムの多様化とその応用
  • (**) CRISPRメモ_2017/10/09_Molecular Cell & Cell Stem Cell 特集 (11編)  - 3 . [レビュー]CRISPR技術を介した真核生物ゲノムのBase Editing (BE)の手法と応用
成果
  • 中国科学院、中国農業大学ならびに上海交通大學醫學院の研究チームは今回、体細胞ゲノムの~400-bpの領域に多様な変異を誘導可能なDBEを作出した。
  • はじめに、先行研究のBE1, BE2, BE3, Target-AIDおよびCRISPR-Xが、HEK293T細胞に形質導入した~100-bpのGFP配列に誘導する変異プロファイルを比較し、この中で、のべ4つのデアミナーゼをMS2を介してsgRNAの2箇所のヘアピン構造に結合させるCRISPR-Xが特異的に、広範に多様な変異を誘導することを確認した。
  • 次に、Quaiらが開発したAID変異体 (Mol Cell, 2017)の一種である単量体AID (本論文でAIDmonoと表記)に注目し、種々のdCas9とAIDmonoの組み合わせを評価し、~100-bpの領域にわたって変異を誘発したCRISPR-XとAIDmonoの組み合わせ (dCas9-sgRNA2XMS2-MS2AIDmono)を候補とした。このDBE-AIDmonoは、変異誘発標的としてモチーフWRC (W:A/T, R:A/G)を好む選択性を伴った。
  • さらに、DBEに組み合わせるデアミナーゼとしてAIDmonoの他に、APOBEC3A (A3A) 、 APOBEC3B変異体(A3BAct) およびrAPOBEC1を評価し、最も変異頻度が高かったDBE-A3Aを候補に加えた。
  • BEとTarget-AIDシステムでは塩基編集の効率を高めたCas9ニッカーゼ (nCas9)を組み入れたnDBEは、sgRNAプロトスペーサ内で、3-10 bpの欠損を誘発した。
  • HEK293T細胞におけるマウス抗NP抗体遺伝子の体細胞超変異 (SHM)誘導と結合親和性向上:DBEを、マウスB細胞CH12F3、HeLa、MCF7など種々の細胞株でテストし、DBEによって多様な配列が生成されたHEK293T細胞 (DNAの修復酵素UNGとMSH2あり)においてSHMを検証した。続いて、DBE-AIDmonoとDBE-A3Aにプール型sgRNAライブラリを組み合わせたSHMの誘導と選択を3ラウンド繰り返し、抗体への結合親和性を2~10倍へ向上させることに成功した。

1. [プロトコル] scGESTALT: トランスクリプトームとCRISPR-Cas9バーコードの単一細胞における読み出しにもとづく大規模な細胞系譜の再構成
[出典] "Large-scale reconstruction of cell lineages using single-cell readout of transcriptomes and CRISPR–Cas9 barcodes by scGESTALT" Raj B, Gagnon JA, Schier AF. Nat Protoc. 2018 Oct 23.
  • ゼブラフィッシュで実証されたscGESTALT法*の詳細プロトコル:(i) トランスジェニック・ゼブラフィッシュの作出;(ii) Cas9による多時点バーコード・アレイの編集;(iii) 脳組織のscRNA-seqライブラリー構築;(iv) 同時に一細胞ごとのバーコードを増幅; (v) シーケンシングとクラスタリング; (vi)細胞型ごとの系譜図
  •  (プロトコル Fig. 1参照);所要期間は(i)に6ヶ月を要し、その後は1ー2週間で
  • CRISPR-Cas9を利用する同様な手法LINNAEUSとScarTraceおよび他の細胞系譜追跡手法との比較、および、scGESTALTの課題も提示
  • LINNAEUS, ScarTraceならびにGESTALTのcrisp_bio記事:細胞バーコーディングとscRNA-seqを一体化して、細胞型の同定と細胞系譜再構築の一石二鳥を実現(3件)
2. [プロトコル] 慢性リンパ性白血病テキストブック掲載CRISPR-Cas9技術プロトコル
[出典] Malek S. (eds) Chronic Lymphocytic Leukemia. Methods in Molecular Biology. 2018 Oct 23.
3. 転写因子CTCFの発現が、体細胞の生存と癌の発生抑制に必須である
[出典] "CTCF Expression Is Essential for Somatic Cell Viability and Protection against Cancer" Bailey CG [..] Rasko JEJ. Reprints. Posted 2018 0ct 19. (not peer-reviewed)
  • ヒト慢性骨髄性白血病由来K562、マウス胚由来線維芽細胞 (MEF)、マウス個体およびヒト子宮内膜癌培養細胞において、CTCF遺伝子を標的とするCISPR/Cas9遺伝子編集とshRNAノックダウンにより、CTCFはプロ不全が、体細胞/癌細胞に与える影響を分析
4. [レビュー] CRISPR-Cas技術の発展と医療への応用
[出典] Review "Blossom of CRISPR technologies and applications in disease treatment"  Liu H, Wang L, Luo Y (Sichuan University and Collaborative Innovation Center of Biotherapy). Synth Syst Biotechnol. 2018 Oct 22.
  • CRISPR ko/a/i、クロマチン可視化、1塩基編集 (BE)、エピゲノム編集、核酸検出などのツール;Casタンパク質の多様化;CRISPR治療 (in vivo 遺伝子治療、細胞療法、耐性菌対応、免疫療法)
5. [レビュー] CRISPR/Cas9ゲノム編集におけるモザイク発生の原因と対策
[出典] Review "Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated Genome editing" Mehravar M, Shirazi A, Nazari M, Banan M. Dev Biol. 2018 Oct 22.
  • CRISPR/Cas9遺伝子編集に付随するモザイク発生は、特に、胚の編集由来のファウンダーマウスで問題になる。モザイク発生の分子機構と体外受精卵へのCRISPR RNP送達の採用などの対策をレビュー
6. [レビュー] 安全なCRISPR: 課題と解決策
[出典] Review "Safe CRISPR: Challenges and Possible Solutions" Pineda M, Lear A, Collins JP, Kiani S. Trends Biotechnol. 2018 Oct 20.
  • ゲノム編集の分子機序の解明が進み、高精度な時空間制御が可能になりつつあり、CRISPR技術による治療と遺伝子ドライブも実用化に向かいつつある;CRISPR技術によるex vivoとin vivoの治療法の治験が米国と中国で始まったが、倫理的、法的および社会的考察が必要;CRISPR技術による遺伝子ドライブの野外実験には、生態および進化のダイナミクスの研究が必要
7. 卵菌類Aphanomyces invadansのCRISPR/Cas9ゲノム編集
[出典] "Editing the genome of Aphanomyces invadans using CRISPR/Cas9" Majeed M, Soliman H, Kumar G, El-Matbouli M, Saleh M. Parasit Vectors. 2018 Oct 23;11(1):554.
  • A . invadansは魚類の流行性潰瘍性症候群 (EUS)の病原真菌である。今回、EUSの毒性をもたらすと想定されていたA . invadansの細胞外セリン・プロテアーゼを標的とするCas9-sgRNAのRNPを、A. Invadansとその遊走子に送達し、セリンプロテアーゼの生産ひいてはEUSの発生を阻害することを同定
8. Pseudomonas aeruginosaとそのウイルスにおけるCRISPR-Cas免疫のMetapopulation (メタ個体群)構造
[出典] "Metapopulation Structure of CRISPR-Cas Immunity in Pseudomonas aeruginosa and Its Viruses" England WE, Kim T, Whitaker RJ. mSystem. 2018 Oct 23.
  • 日和見感染菌P. aeruginosaに感染するウイルスが、嚢胞性線維症 (CF)患者の生理と予後に影響を与えることが明らかになってきた。 University of Illinois at Urbana-Champaignの研究チームは今回、コペンハーゲンのCFクリニックのCF患者の時系列データからP. aeruginosaのCRISPRアレイを再構築し、スペーサが同一患者内では変動しないが、患者間で多様なことを見出した。この限られたデータセット由来のローカルなスペーサの多様性は、NCBIのSRAからアッセンブルした726種類のP. aeruginosaゲノム由来CRISPRアレイに見られるグローバルなスペーサの多様性を包含していた。
  • 次に、グローバルな~3,000のスペーサを、P. aeruginosaに感染する溶菌性および溶原性の98種類のウイルスゲノムと比較し、溶原性ウイルスゲノムにより高頻度でスペーサ標的を見出した。
9. CRISPR技術による生殖細胞系列の編集は、子供達にとっての開かれた未来への扉を閉じてしまうのか?
  • [出典] "Will CRISPR Germline Engineering Close the Door to an Open Future?" Mintz RL, Loike JD, Fischbach RL. Sci Eng Ethics 2018 Oct 24.
  • 生殖細胞系列ゲノム改変の倫理的課題は、胚が自律的判断を表明できない点にある。哲学者Joel Feinbergはかって、自律性は出生後に発達するとし、子育ての間の親の倫理的判断は、子供達が将来自律的判断を下せるように導かれるべきとした。著者らは、生殖細胞系列の編集の多くは、この"Feinberg’s 1980 open future theory"*に反するという観点から論考:(*) "The foundation of the child’s right to an open future" Millum J. J Soc Philos. 2014 Winter;45(4):522-538
10. [コメント] 特許システムを介した遺伝子編集技術の規制を推奨
[出典] "Use the patent system to regulate gene editing" Parthasarathy SNature. 2018 Oct 23.
  • ワシントンDCで開催された第一回から三年を経て第二回International Summit on Human Gene Editingが上海で開催されるが、その間、各国政府とも遺伝子工学に対する既存の規制を援用するにとどまり、また、米国科学アカデミーや英国のNuffield Council on Bioethicsの勧告を活かすこともできず、適切な規制案を見出せないままであった。
  • 一方で、その公開件数が2015年に 700件を超え、さらに2016年には1,000件を超えるに至ったCRISPR-Cas9関連特許が、一種の自律的規制を生み出しつつある。政府も特許システムを介して、技術開発の方向づけを行なってきた歴史がある。古くは、米国における特許システムを介して私企業による原子爆弾開発を規制した例があり、近年では欧州連合理事会が、ヒトの福祉と動物愛護のバランスがとれた動物改変に関する特許に限り承認すべきとした。
  • CRISPR技術については政府の規制を待たず、例えば、Broad Inst.はライセンス契約にて、ヒト胚改変、および、エコシステムまたはタバコの改変を禁じている。また、CRISPRによる遺伝子ドライブを開発したMITのKevin Esveltはライセンス契約にて、利用の目的と内容を公開するように求めている。
  • 著者は、特許システムを利用したより公的で網羅的な規制システムを政府が主導して構築すべきと提案。

[出典] Research Highlight "SIRT6 at the beginning" Neff EP. Lab Animal. 2018 Oct 23.;NEWS AND VIEWS "Role for the longevity protein SIRT6 in primate development" Nature. 2018 Aug;560(7720):559-560.;論文 "SIRT6 deficiency results in developmental retardation in cynomolgus monkeys" Zhang W, Wan H, Feng G, Qu J [..] Li W, Liu GH, Hu B. Nature. 2018 Aug;560(7720):661-665. Online 2018-08-22
  • 中国科学院の研究チームは今回、カニクイザルにおいて、マウスでは見出されていなかったSIRT6タンパク質の機能を同定した。
  • マウスでは、SIRT6がゲノムの安定性、炎症および代謝を含む多様な因子を調節する老化遺伝子として研究が行われており、マウスのオスでは、SIRT6の過剰発現が寿命を伸ばし、SIRT6 欠損マウスは生後数週間で死亡するという報告もなされている。
  • 最近、ヒトES細胞でSIRT6を過剰発現させると、脳の発生異常が起こり、胚致死に至ることが報告された。中国科学院の研究チームは今回、カニクイザルをモデルとして、CRISPR-Cas9技術によって受精卵においてSIRT6をノックアウトし、発生に至ったオス胎仔は懐胎期間中に死亡し、メスは生後数時間で死亡することを見出した (SIRT6欠損したヒトは誕生に至らない)。
  • 野生型カニクイザルは懐胎6ヶ月で出生し、SIRT6タンパク質によって長鎖ノンコーディングRNAの一種であるH19遺伝子の発現が抑制されていた。SIRT6を欠損したメス・カニクイザルは脳の発生不全を含む発育不全が起こし、サイズが2-4ヶ月の野生型胎仔相当であり、脳を始めとする全ての組織でH19遺伝子の発現が極めて亢進していた。
  • 続いて、SIRT6欠損ヒト神経前駆細胞の分化が野生型よりも遅れ、H19 RNAレベルが高いことを見出した。また、H19の発現抑制により、神経細胞分化の不全が修復されることを示した。
  • SIRT6タンパク質はさまざまな組織で数千遺伝子の発現を調節することが知られており、また、H19の発現が上昇していることにより発症するSilver–Russell症候群の患者の寿命は健常人と変わらない事例などから、H19遺伝子の欠損だけが今回観察された不全の原因とは考えられない。
  • マウスからカニクイザルそしてヒトへの進化に伴って、SIRT6の欠損の重篤化と、脳の複雑性の増加が、並行していることは興味深い。
  • 老化との関連に戻ると、SIRT6遺伝子の標的遺伝子が膨大であり、また、GWAS解析からSIRT6遺伝子とヒト長寿化の相関が同定され、SIRT6タンパク質がアルツハイマー病などの老化に関連する神経変性から脳の保護に関与することも知られていることなどから、SIRT6タンパク質の発現が、ヒトの発生と長寿化の双方に関与すると見て良いだろう。
  • カニクイザル実験関連crisp_bio記事:2018-01-25 クローン羊(Dolly)から20年余りを経て、クローンサル(Zhong ZhongとHua Hua)誕生CRISPRメモ_2018/01/17 3. CRISPR/Cas9によるカニクイザルへのノックイン 2報 (論文へのリンクのみ)

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