2019年04月

[出典] "Structural basis for the promiscuous PAM recognition by Corynebacterium diphtheriae Cas9" Hirano S [..] Nishimasu H, Nureki O. Nat Commun. 2019-04-29;構造情報 PDB 6JOO: Crystal structure of Corynebacterium diphtheriae Cas9 in complex with sgRNA and target DNA (2.9 Å 分解能)

概要
  • C. diphtheriae Cas9 (CdCas9)のPAMはNNRHHHY (N=A/C/G/T; R=A/G; H=A/T/C; Y=C/T)と'promiscuous'であり、Cas9オーソログのほとんどがG-richなPAMを認識するのに対して、CdCas9はG-lessなPAMも認識する。
  • 東大と群大ならびにBroad Instituteの研究グループは、CdCas9/sgRNA/標的DNAの三者複合体構造を分解能2.9 Åで決定し、CdCas9が独特なPAMを認識する機構は、ファン・デル・ワールス相互作用と塩基特異的水素結合の協働に依存することを明らかにした。
詳細
  • 研究グループはCdCas9のPAM配列についても、改めて、CdCas9-sgRNA22によるプラスミド切断実験で検証し、第1/2塩基には縛りがなく、第3塩基のRが必須であり、第4塩基から第6塩基にはアデニンへの偏りが存在することを見出した。
  • CdCas9の活性については、in vitroでのDNA切断速度が遅く、ヒト細胞内では標的にindelsを誘導しないことが、報告されていた。これまでの報告は20-ntの長さのsgRNAを使用していたが、Cas9オーソログのgRNAにはそれぞれ最適な長さが存在する(SpCas9, SaCas9およびCjCas9、それぞれ、20-, 21-および22-nt)。
  • 研究グループは今回、精製したCdCas9と20~24-ntの長さのsgRNA20~sgRNA24によるin vitro DNA切断実験を行い、sgRNA20では先行研究同様にDNA切断活性を示さなかったが、sgRNA21~sgRNA24を使用した場合はCdCas9がDNA切断活性を示し、sgRNA22が最適であり、SpCas9よりも遅いが2分以内にDNAを切断することを特定した。
  • HEK293FTのDNMT1DYRK1AまたはEMX1を標的とするsgRNA20~sgRNA24は、in vitro実験結果と異なり、いずれも編集活性を示さなかった。
  • ラット受精卵にRNPとしてマイクロインジェクションした場合は、 CdCas9-sgRNA22がTet1EX4Tet1EX12に対してそれぞれ5%と8%の編集効率、CdCas9-sgRNA24がTet1EX12に対して56%の編集効率を示した。
  • 結晶構造解析にあたって、CdCas9の全長結晶が得られなかったため、HNHドメインをGGGSCCリンカーで置換したCdCas9-ΔHNHと112-nt sgRNA (20-nt gRNA)ならびに28-ntの標的DNAの三者複合体の構造を決定した(Fig. 2 引用左下図参照)。全体構造はSaCas9、SpCas9ならびにFnCas9よりもCdCas9により近いが (Fig. 3 引用右下図参照) 、CdCas9のDNA切断機序は他のCas9オーソログと類似していることを示唆する構造であった。
CdCas9 2 CdCas9 3
  • CdCas9とsgRNA結合の構造基盤およびPAM認識の構造基盤についても、他のCas9オーソログと比較しながら詳細に論じた。

[出典] "Cholesterol Induces CD8+T Cell Exhaustion in the Tumor Microenvironment" Ma X, Bi E [..] Yi Q. Cell Metabolism. 2019-04-25

 腫瘍浸潤T細胞は高頻度で抗腫瘍性を失う。Houston Methodist Research Institute (以下、HMRI) を主とする研究グループは、腫瘍微小環境のコレステロールがERストレス-XBP1の経路を介してCD8+T細胞を疲弊させることを明確にし、コレステロールレベル低減またはERストレス抑制によりCD8+T細胞の抗腫瘍性を活性化可能なことを示した:
  • 腫瘍組織内のコレステロールレベルと腫瘍浸潤CD8+T細胞内のコレステロールレベルが、PD-1、2B4、TIM-3ならびにLAG-3の発現と正相関。
  • 腫瘍細胞株へ養子移植した (adoptively transferred) CD8+T細胞は、コレステロールを取り込み、免疫チェックポイント分子を高発現させ、疲弊。
  • CD8+T細胞を腫瘍細胞培養上清またはコレステロールに暴露すると、脂質代謝異常が生じ、小胞体ストレス (ERストレス)が上昇し、免疫チェックポイント分子発現亢進。
  • ERストレスのセンサーXBP1が活性化され、PD-1と2B4の転写を調節。
  • XBP1阻害、または、腫瘍微小環境や腫瘍浸潤T細胞におけるコレステロールレベル低減によって、抗腫瘍活性亢進
crisp_bio注
背景 (原論文Introductionに準拠)
  • 腫瘍浸潤CD8+T細胞は、抗原に繰り返し暴露され、また、腫瘍微小環境による免疫抑制を受けて、徐々に抗腫瘍活性を失い疲弊し、PD-1、LAG-3、TIM-3、2B4、CTLA-4といった免疫チェックポイント分子を高発現するに至る。免疫チェックポイント分子、中でもPD-1、を標的とする抗体による癌免疫療法はかってない著効を示すが、一方で、低い奏効率、毒性および再発の課題を伴うことから、免疫チェックポイント発現の調節機構と、免疫チェックポイントを標的とする新たな戦略が必要とされている。
  • これまでに、PD-1の発現を調節する因子として、STAT3、STAT4、NFATc1、T-bet、およびBlimp-1といった転写因子や、DNAメチル化やヒストン修飾が報告されてきた。また、TIM-3の発現を調節する因子として、T-bet、AP-1およびc-Junが報告されている。これらのT細胞のゲノムおよびエピゲノム に由来する因子に加えて、近年、免疫抑制性の腫瘍微小環境に由来するT細胞の疲弊に関与する因子が、治療標的として注目を集め始めた。腫瘍微小環境調節因子でもあるTGF-βや腫瘍細胞に由来するVEGF-Aといった因子がもたらす免疫チェックポイント分子の発現亢進の他に、コレステロール代謝を調節することで、CD8+T細胞の抗腫瘍応答強化が可能なことも報告されている (Nature, 2016)。

[出典] "Novel screening system revealed that intracellular cholesterol trafficking can be a good target for colon cancer prevention" Miyamoto S [..] Mutoh M. Sci Rep. 2019-04-17.
  • がん化学予防は、天然物、合成または生物学的製剤を利用して、発がんの初期または前がん状態の細胞のがん細胞への進行を、逆行、抑制または予防する手法を言う。国立がんセンターの研究チームは今回、がんの初期段階の'hallmark'とされた細胞増殖とアポトーシスを指標とする化合物スクリーンに替えて、正常細胞または良性腺腫の悪性形質転換を予防する観点からの化合物スクリーンを行ない、大腸がんの化学予防薬候補として既存の抗真菌薬を同定した。
  • PDIS (Platform for Drug Discovery, Informatics, and Structural Life Science)事業の支援を受けて設立された東京大学創薬機構が提供する化合物ライブラリーのうちValidated Compound Library (リポジショニングや構築アッセイ系の確認に用いられるサンプルのセット既存薬 約1500サンプル、既知薬理活性試薬 約1900サンプル)由来の既存薬1,280サンプルを対象として、それぞれ未分化状態の維持と炎症反応の誘導に関与する転写因子TCF/LEFとNF-κβの活性を抑制し、抗酸化ストレスに寄与する転写因子NRF2の活性を亢進する化合物8種類を大腸がん予防薬候補として同定した。
  • その中で 、経口抗真菌剤として承認されているイトラコナゾールを、家族性大腸腺腫症モデルのMinマウス (Jackson eNews)で評価し、イトラコナゾールが腸ポリープ形成を顕著に抑制することを見出した。また、この抑制効果が、部分的に、イトラコナゾールのコレステロールの細胞内輸送阻害を介した転写因子の活性調節に由来することが、示唆された。
  • 本研究は、がん化を予防する観点からの化合物スクリーニングが薬剤候補同定に有効であり、コレステロールの取り込みに加えてコレステロールの細胞内輸送の抑制も大腸がん予防の標的であり、また、既存薬の承認時の対象疾患と異なる疾患の治療への再利用 (drug repositioning/repurposing/reporiling)*が創薬の手法として有効であることを示した。
  • (*) ドラッグ・リポジショニングは、長い時間と巨額の経費を必要とし、また、候補薬のドロップアウトが発生する段階である安全性試験の回避が可能になることから、注目を集めている創薬手法である。

[出典] "Artificial sgRNAs engineered for genome editing with new Cas12b orthologs" Teng F, Cui T, Gao Q,  Guo L, Zhou Q, Li W. Cell Discov. 2019-04-23.

概要
  • State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology (Beijing)の研究チームは今回、ヒト細胞ゲノム編集に利用されているタイプⅡCas9、タイプV-A Cas12aおよびタイプV-B Cas12bの中で、より小型で標的特異性がより高いCas12bゲノム編集ツールボックスを拡張した。
新奇Cas12bによる拡張
  • その特徴から応用展開が期待されるCas12bの中で実用になっているのはAsCas12bとAkCas12bの2種類だけであある。そこで、研究チームはゲノムデータベースのPSI-Blast検索から新たに同定・合成したCas12b4種類 (BhCas12b, Bs3Cas12b, LsCas12b, と SbCas12b)と、既知のAsCas12bとAkCas12bおよびAmCas12bとBsCas12bの8種類のCas12b(Figure S1引用左下図参照)について、dsDNA切断活性を測定した。
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  • ヒト293T細胞へ、各Cas12bと、その同系でCCR5DNMT1を標的とするsgRNAsを導入し、既知のAsCas12bとAkCas12bに加えて、4種類の新奇Cas12bもdsDNA切断活性を帯びていることを同定した (Fig. 1 - a/b引用右上図参照)。また、BsCas12bについては、多重sgRNAsを利用した4重同時編集が可能なことを実証した。
tracrRNA:crRNA (sgRNA)とCRISPRエフェクタの組み合わせの互換性を利用した拡張
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    二本鎖と近縁Cas9の組み合わせにPAMの調整を前提として互換性があること (NAR 2014; 左下図の上Figure 6 参照)、この互換性がCRISPRアレイのダイレクトリピートの保存性が高いCpf1/Cas12a (Cell 2015)の間にもあることが、報告されている。
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  • 研究チームは、8種類のCRISPRシステムの間で、Cas12bオーソログのアミノ酸配列と、pre-crRNA:tracrRNA二本鎖のDNA配列ならびに2次構造の保存性が高いことを見出し、前述の互換性の検証実験を行なった。その結果、AaCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12bおよびLsCas12b遺伝子座に由来するsgRNAsが同系のsgRNAsと互換であり、活性を示すことを見出した (As-sgRNAとAk-sgRNAの場合について、上図下Fig. 1-c/d参照)。そこで、CRISPRアレイが不明なCas12bに、同系ではないsgRNAsを組み合わせる実験を進めた。
  • crRNA:tracrRNA二重鎖が予測不可能であったD. inopinatus (DiCas12b)とT. calidus (TcCas12b)を合成し 、前述の8種類のCas12aそれぞれの同系sgRNAとの組み合わせについてdsDNA切断活性を測定し、TcCas12bが、5種類のCas12b (Aa; Ak; Am; Bs3; Ls)同系sgRNAsとの組み合わせによりdsDNA切断活性を示し、As-sgRNAまたはAk-sgRNAを利用した多重編集に利用可能なことを、見出した (Fig.1-e/f/g 引用左下図と、右下図Fig. 1-h参照)。
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  • さらに、CCR5遺伝子座を標的とするsgRNAsを、今回同定したCas12bオーソログ間でのDNA配列と2次構造の保存性に注目して37種類設計し(artificial sgRNA, artsgRNA)、TcCas12bとの組み合わせで活性を示す22種類のartsgRNAを同定した (artsgRNA13の例について右上図 i/j参照)。TcCas12bとAaCas12bおよびAsCas12aとFnCas12aにそれぞれartsgRNA13を組み合わせてindels頻度を測定し、artsgRNA13がTcCas12bとAsCas12bの活性を、AsCas12aを超え、標的遺伝子座に依存するが、FnCas12aと同じレベルまで亢進することも見出した (右上図 k 参照)。
 参考crisp_bio記事

1. 高精度版CRISPR-Cas9の活性を、tRNAGlnプロセシング・システムを利用して、ブーストする
[出典] "Boosting activity of high-fidelity CRISPR/Cas9 variants using a tRNAGln-processing system in human cells" He X, [..] Gu F. J Biol Chem. 2019-04-22.
  • オフターゲット作用を抑制した高精度版Cas9は往々にして活性が低い。温州医科大学と中国科学院遺伝与発育生物学研究所の研究グループは今回、sgRNAの5'末端への1塩基 (AまたはG)付加が高精度版Cas9の活性に顕著な影響を与え、また、tRNA-sgRNAの融合がCas9の活性を向上させることから、20塩基からなるsgRNAにGと各種tRNAを融合したG-tRNA-N20が高精度版Cas9 (SpCas9-HF1; eSpCas9 ; xCas9)のDNA切断活性に与える効果を、HEK293細胞において分析し、tRNAGln-sgRNAが最も効果的であることを同定し、若年性網膜分離症の原因タンパク質をコードするretinoschisin 1 (RS1) 遺伝子の病原性変異修復実験において、活性のブーストを実証した。
  • 関連crisp_bio記事: CRISPRメモ_2018/04/16 1. Cpf1による哺乳類ゲノムの編集効率向上を、gRNAへのtRNA前駆体挿入によって実現
2. Cas9-sgRNA RNPによる担子菌酵母Pseudozyma antarcticaイタの高効率な遺伝子置換を実現
[出典] "CRISPR/Cas9-mediated gene replacement in the basidiomycetous yeast Pseudozyma antarctica" Kunitake E [..] Kitamoto H. Fungal Genet Biol. 2019-04-23.
  • 農研機構の研究チームは、産業上有用な生分解性プラスチックを分解する酵素 (PaE)と糖脂質を発現可能なP. antarcticaイタにおいて、そのプロトプラストとRNPならびに選択マーカを帯びたドナーDNAを共培養することで、長い (> 0.1 kb)相同アームにて、PaEの効率的遺伝子置換が可能なことを実証した。また、PaADE2イタ遺伝子の場合は、相同アームを伴わないドナーDNAも挿入されることを見出した。
3. ベータ二項分布モデルにより、プール型CRISPRスクリーンデータの感度の高く偽陰性が少ない解析が可能になる
[出典] "Beta-binomial modeling of CRISPR pooled screen data identifies target genes with greater sensitivity and fewer false negatives" Jeong HH, Kim SY, Rousseaux MWC, Zoghbi HY, Liu Z. Genome Res. 2019-04-23.
  • プール型CRISPRスクリーンからの大量配列データの解析には、ロバストな標的同定を可能とする統計モデル、sgRNAレベルの定量をもたらす精密マッピングのアルゴリズム、微調整に必要なパラメーター数の抑制、が必要である。Baylor College of MedicineとTexas Children’s Hospitalの研究グループは今回、より信頼性が高く容易に利用可能なアルゴリズムCRISPRBetaBinomial (CB2)を開発し、よく利用されている8種類のプログラム (HiTSelect, MAGeCK, PBNPA, PinAPL-Py, RIGER, RSA, ScreenBEAMおよびsgRSEA)に優るとし、Amazn Web Service上のCRISPRcloudから公開した。
4. 植物ssDNAウイルスを標的とするCRISPR-Cas14a
[出典] "Targeting Plant ssDNA Viruses with Engineered Miniature CRISPR-Cas14a" Khan MZ, Haider S, Mansoor S, Amin I. Trends Biotechnol. 2019-04-22.
5. CRISPR-Cas9遺伝子編集により、バレイショ (シカゴ種)の耐性機構における核タンパク質coilinの機能を同定
[出典] "Functional Analysis of Coilin in Virus Resistance and Stress Tolerance of Potato Solanum tuberosum using CRISPR-Cas9 Editing" Makhotenko AV, Khromov AV, Snigir EA.et al. Dokl Biochem Biophys. 2019-04-22
  • Cas9とgRNAを金またはキトサンの粒子に固定化し、それぞれ微粒子銃法または真空浸潤法によって、分裂組織細胞へ導入し、coilin遺伝子のすくなくとも1つのアレル損傷が、バレイショのウイルス感染と塩ストレスと浸透圧ストレスへの耐性が高まることを見出した。
6. カイコにおいて標的特異的脱メチル化を実現
[出典] "Programmable targeted epigenetic editing using CRISPR system in Bombyx moriイタ" Liu Y [..] Xia Q. Insect Biochem Mol Biol. 2019-04-22
  • 西南大学の研究チームがdCas9にDNA脱メチル化酵素の一種であるTET1を融合し、ゲノムDNAでメチル化されていることが知られている3ヶ所の標的に特異的で高効率な (17.5 ~ 40.00%)脱メチル化を実現

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