2019年07月

1. CRISPR-Cas9 HDRを亢進するRAD18バリアントを同定
[出典] "Stimulation of CRISPR-mediated homology-directed repair by an engineered RAD18 variant" Nambiar1 TS [..] Ciccia A. Nat Commun 2019-07-30.
  • Columbia University Irving Medical Centerの研究グループは、CRISPR-Cas9 HDRを亢進する観点から、ヒトDNA損傷応答 (DDR)に関与するオープンリーディングフレーム (ORFs)204種類をスクリーニングし、複製後修復とHDRに関与するRING型E3ユビキチンリガーゼであるRAD18が、ssODNおよびdsDNAをテンプレートとするHDRいずれについても、最も強力に亢進する因子であることを同定した。
  • さらにHDR亢進に必須のドメインを機能解析から同定し、効率と特異性を向上させた (enhanced) RAD18バリアント (e18)を誘導した。e18バリアントの効果は、53BP1のDSBsへの局在を阻害し、ひいては、HDRと競合するNHEJを介したDSB修復を阻害することでもたらされる。
  • e18は、HEK293T細胞、HeLa細胞、U2OS細胞ならびにヒトES細胞において多様な遺伝子座におけるHDRを亢進した (原論文Fig. 5引用下図参照)。e18
2. SpyCas9のDNA切断活性には、HNHヌクレアーゼドメインの残基N863が決定的な役割を果たしている
[出典] "Structural and functional insights into the bona fide catalytic state of Streptococcus pyogenes Cas9 HNH nuclease domain" Zuo Z [..] Wang YC, Liu J. eLife 2019-07-30.
  • SpyCas9の構造とDNA切断機構について共通理解が進んできたが、HNHヌクレアーゼドメインのDNA切断可能な状態のコンフォメーションについては決着がついていない。
  • 上海工程技術大学、University of North Texas Health Science CenterならびにUniversity of Oklahomaの研究グループは今回、in silico (ホモロジーモデリング;分子動力学シミュレーション;QM/MMシミュレーション)およびDNA切断実験から、HNHドメインが、これまでに示唆されたD839-H840-D861、D839-H840-N854、D837-D839-H840またはD839-H840-D861-N863ではなく、D839-H840-N863で触媒活性部位を構成することを、明らかにし、D861が活性中心に向きMgイオンの活性中心への配位と標的鎖切断を担うとした構造は“psuedoactive state”の構造であるとした (原論文Figure 2引用下図参照)。SpyCas9
3. CRISPRiとCRISPRaの多重化に対するdCas9ボトルネック
[出典] "Modeling predicts that CRISPR-based activators, unlike CRISPR-based repressors, scale well with increasing gRNA competition and dCas9 bottlenecking" Clamons S, Murray R. bioRxiv 2019-07-30
  • dCas9に転写因子 (transciption factors: TFs)を融合した人工因子 (CRISPRtf)で、遺伝子発現抑制/活性化をもたらすCRISPRi/aシステムの構築が容易になった。このCRISPRtfによって、宿主遺伝子の発現調節や、小規模な転写調節回路の構築も容易になったが、スケーラビリティーが課題となっている。dCas9ボトルネックとは、CRISPRftsのネットワークの中で一つのgRNAの発現は、その他のgRNAsをdCas9から隔離することで、sgRNAsを介したCRISPRi/aの活性が損なわれていく現象である。
  • ZhangとVoigt (NAR 2018)はdCas9ボトルネック現象として、E. coliにおいて、CRISPRiの遺伝子発現抑制の活性がgRNAs同時使用数の増加とともに低下し、7 gRNAsを超えると10分の1にまで低下することを報告している (低毒性のdCas9バリアント、dCas9*-PhIF、の場合は、~ 15 gRNAsにて) [*1]。バクテリアにおいてCRISPRaの活性は低く当時はCRISPRaに対するdCas9ボトルネック現象は関心を集めなかったが、その後、他の因子を併用することなくdCas9にSoxSを融合するだけでバクテリアにおける実用的なCRISPRaが実現された [*2]。
  • Caltechの研究チームは今回、Chenらによって提案され [*3]、ZhangとVoigt[*1]がCRSIPRiのdCas9ボトルネック効果解析に利用したモデルに基づいて、CRISPRaに対するdCas9ボトルネックを評価した。
  • その結果、CRISPRaはCRISPRiとは異なり、数十から数百のgRNAsを同時使用しても、10倍を超える活性化を維持可能であるとし、転写調節回路構築のツールとしてCRISPRaを推奨した。
参考文献と記事
4. TALEN HDRを介したウシの生殖細胞系列のゲノム編集の際に、テンプレート・プラスミドが取り込まれる
[出典] "Template plasmid integration in germline genome-edited cattle" Norris AL, Lee SS [..] Lombardi H. bioRxiv 2019-07-28
  • FDAの研究チームは今回、無角遺伝子の導入を目的とするTALEN HDRを介した生殖細胞系列ゲノム編集を加えたウシの全ゲノム配列の公開データを解析し、目的外のプラスミドバックボーンと第2のHDR用テンプレート配列がゲノムにヘテロに組み込まれることを見出し (投稿Fig. 1引用下図参照)、プラスミドと多重なテンプレートの組み込みへの注意を喚起した。TALEN HDR

[出典] "Titrating gene expression with series of systematically compromised CRISPR guide RNAs" Jost M, Santos DA [..] Weissman JS. bioRxiv 2019-07-28 > Nat Biotechnol. 2020-01-13.

背景
 細胞機能の解明には、遺伝子発現のオン・オフを可能にするバイナリー制御法だけでなく、遺伝子発現レベルの調節を可能にするアナログ制御技術が必要である。バクテリアと酵母の場合は、一連のプロモータや低発現(hylomorphic)変異体を利用することで、発現レベルと表現型の関係を体系的に解析することが可能になっている。哺乳類の場合は最近になって、マイクロRNA応答エレメント (MREs)のライブラリmiSFITs (miRNA silencing-mediated fine-tuners) [*1]による遺伝子発現のアナログ制御が実現され (Nat Commun 2019)、また、dCas9に転写を調節するエフェクタを融合するCRISPRi/a技術により一連の遺伝子の転写を抑制あるいは活性化することが可能になった。

成果
 UCSFの研究グループは今回、CRISPRiシステムにおいて、標的配列とのミスマッチを導入したsgRNAバリアントを利用することで、dCas9の標的サイトへの結合を調節する手法を開発し、ヒト細胞において遺伝子発現のアナログ制御を可能とする汎用的ツールを実現した。
  • 2,499遺伝子を標的とする4,898種類のsgRNAsのバリアント ~120,000種類(*)からなるプール型sgRNAsライブリーによるK562細胞とJurkat細胞の増殖抑制効果を測定し、標的配列と完全一致するsgRNAとネガティブコントロールsgRNAと比較し、中間的な活性を示すsgRNAバリアント19,596種類を同定した [(*) sgRNAあたり、1ヶ所または2ヶ所のミスマッチを帯びた22-23種類のバリアント]。
  • このデータを基にして、convolutional neural network (CNN)のアルゴリズムにより、sgRNAバリアントの活性予測モデル (以下、CNNモデル)を構築した。同時に、elastic net linear regression modelも構築し、sgRNAバリアントの活性に影響を与える因子について考察を加えた。
  • 必須遺伝子として2,405遺伝子を選択し、K562細胞での実験結果とCNNモデルから、1遺伝子あたり8種類のsgRNAsバリアントを含むコンパクトなsgRNAライブラリを設計し、K562細胞とHeLa細胞で検証した。
  • sgRNAsバリアントによるプール型スクリーンの結果をPerturb-seq[*2]により解析することで、遺伝子発現レベルを表現型へマッピングすることが可能であり、また、細胞運命の遺伝子発現レベル依存性の同定も可能なことを示した。
参考記事
 [2020-01-14追記] Nature Biotechnologyツイートのリツイート追加

[出典] "Enhancing gene editing specificity by attenuating DNA cleavage kinetics" Miller JC [..] Rebar EJ. Nat Biotechnol 2019-07-29.

 部位特異的ヌクレアーゼによりゲノム編集の効率が格段に向上したが、標的に対する特異性は未だ改善すべき課題として残っている。臨床応用には特に、オフターゲットの切断を回避することが必須である。Sangamo社の研究グループは今回、ZFNsの特異性の向上を、CROSPR-Cas9の切断活性を減弱することでオフターゲット編集を抑制するCRISPR-Cas9の特異性をCas9の切断活性を弱めることでオフターゲット編集を抑制する手法に倣うことで、実現した。
  • 研究グループは始めに、 K562細胞のセーフハーバー遺伝子座AAVS1と4種類の既知のオフターゲット (OT1-4)のZFN編集を測定する系において、オンターゲット編集の効率を向上し、オフターゲット編集を抑制する一連の残基置換を同定し、中でもFokI触媒活性ドメインにおけるQ481Aが、オフターゲット切断活性に対して~3,000倍を超えるオンターゲット切断活性(OT1:85.5%/0.0024%=35,600)をもたらすことを同定した。
  • こうしたFokIの残基置換によって、Fok1の触媒反応速度を抑制し、ひいてはZFNの結合親和性が相対的に低いオフターゲットの編集効率を効果的に抑制することに成功した。
  • 研究グループはさらに、ジンクフィンガー・モチーフのDNAへの非選択的結合を回避する置換を同定し、オフターゲットへの結合親和性自身の抑制も加えた。
  • この2重のZFN改変により、オフターゲット編集を検出限界未満 (感度 ~0.01%)にまで抑制しつつ、T細胞におけるTRACイタ遺伝子座のノックアウト効率 > 98%を実現し
関連crisp_bio記事

[出典] "Large dataset enables prediction of repair after CRISPR–Cas9 editing in primary T cells" Leenay RT, Aghazadeh A, Hiatt J [..] Marson A, May AP,  Zou J. Nat Biotechnol. 2019-07-29.

 Cas9が誘導するdsDNA切断からの修復結果の予測は、特にヒト初代細胞については、未だ困難である。UCSF, Stanford U, Chan–Zuckerberg Biohubなど米国研究グループは今回、ヒト初代T細胞ゲノム編集の実験結果に基づいて、修復結果に発生するヌクレオチドの挿入・欠失のサイズ、誘導確率および配列を精密に予測する機械学習モデルSPROUT (CRISPR Repair Outcome)を構築した。

 18名の健常者 (ドナー)に由来するCD4陽性初代T細胞へ、556種類の遺伝子内のべ1,656ヶ所を標的とするSpCas9-gRNAs RNPをエレクトロポレーションし、その6日後にDNAを抽出・増幅し、標的サイトの180- から260- bp領域をPCR後にシーケンシングし、CrispRVariants [*1]によって標的サイト領域に発生する挿入・欠失のプロファイルを判定した。
  • 切断サイトの膨大なリードの31%に平均長さ13 bpの欠失が、20%に挿入が見られ、欠失と挿入が共存したリードは0.008%であった。
  • 切断サイトあたり、1,000リードに1回以上出現する修復プロファイルが平均98種類見られ、切断サイト間で挿入・欠失のサイズと比率が大きく変動した。
  • 同一サイトにおけるドナー間の変動は小さかった。

 研究グループは、標的サイト間の切断結果の変動が大きいことは、切断サイトに近い領域における配列の多様性に由来するという仮説のもとに、勾配ブースティング (Gradient boosting)アルゴリズムに基づいて、20-ntのスペーサ配列とPAM配列を入力として、挿入または欠失、および挿入・欠失のサイズを予測するSPROUTを開発した。
  • 初代T細胞において、SPROUTの学習に利用した1,656ヶ所とは異なる304ヶ所で、検証し、挿入・欠失のプロファイル予測に加えて、フレームシフトの発生三段階 (>60%, 40-60%, <40%)も精度よく予測可能なことを確認した。
  • また、SPROUTによって、各遺伝子にフレームシフト誘導効率からみたgRNAsのランキング、各遺伝子への挿入・欠失に効果的な標的サイトのランキングが可能なことも示した。
  • さらに、修復プロファイルと相関する切断サイト周囲の配列の特徴を論じた。
  • SPROUTの開発を進めた初代T細胞のデータセット内での検証に加えて、HEK293K562およびHCT116の各細胞を対象とするSpCas9編集結果の公開データのSPROUTによる再解析により検証した。
  • また、先行研究の機械学習モデルinDelphi [*2]ならびにFORECast[*3]修復プロファイル予測性能を比較した。SPROUTの構築には使用しなかった初代T細胞におけるCXCR4遺伝子をカバーする32サイトと91種類の免疫関連遺伝子上の32サイトを標的とする予測精度、および、ヒトiPSCにおけるCXCR4 32サイトを標的とする予想精度を比較し、SPROUTが最も高精度であることを確認した (P < 0.01)。
 研究グループはまた、SpCas9標的サイトの90%において、長い (> 25 bp)挿入DNAを見出した。その27%が標的サイトから1 kb以内の配列に由来し、9%が同一染色体の領域に由来し、残りは全て、Hi-C解析から標的サイトと相互作用すると推定される他の染色体ゲノム領域に、アラインしたことから、SpCas9によるdsDNA切断からの修復時には、細胞空間で物理的に近い距離にあるゲノムに由来するDNA断片が、取り込まれることを示唆した。

参考記事

[NEWS RELEASE] "Designed switch allows unprecedented control over cells" UW Medicine Newsroom 2019-07-24.  [YouTube: 2m51s] Controlling cell functions with a designed switch 
  • David Baker (UW Medicine Institute for Protein Design、以下UW)とHana El-Samad (UCSF)が率いるバイオエンジニアリング・グループは、生細胞内の複雑な遺伝子回路を調節あるいは乗っ取る (commandeer)ことも可能とする長さ8 nmの自己組織化するタンパク質スイッチ'Latching, Orthogonal Cage/Key pRotein (LOCKR)'を開発し、その設計と応用をNatureにて姉妹論文として発表した。LOCKRは完全な人工物であることから、光遺伝学やCRISPRといった最新技術を含むこれまでのバイオテクノロジーと一線を画している。
  • 研究グループはLOCKRによる、遺伝子発現調節、細胞内輸送の方向変更、特定タンパク質分解、および、タンパク質間相互作用の制御を、酵母およびヒト細胞において、実証した。さらに、LOCKRにより、自律センサとして機能する一連の新規な生物学的回路を合成した。これらの回路は、細胞内または細胞の外部環境からのキューを検知し、しかるべき細胞応答を起動し、しかるべく終了させる。
  • LOCKRはInstiture for Protein Designのツイートから引用した下図にあるように、活性部位から遠い部位への分子結合に伴うコンフォメーションの変化 (アロステリック作用)や、結合時に活性部位のコンフォメーションを変化させる誘導適合 (indced fitting) と同等の効果を、全く異なる機構で実現している。
  • LOCKRは、5重のヘリックスからなる安定なCAGEの同一面への、分子内相互作用によるLATCHペプチドの結合と、分子間相互作用によるKEYペプチドの結合の間の競合に基づいて作動する。OFFの状態では、生理活性ペプチドを帯びているLATCHがCAGEに留められており、ONの状態では、KEYによってLATCHがCAGEから外れることでLATCH上の生理活性ペプチドがCAGEの外部に露出し、生理活性を発揮する。生理活性ペプチドには、標的分子への結合、標的タンパク質分解、核移行シグナルなどの機能を持たせることができる。
  • アロステリック作用の機構をデノボで再現するには、ペプチド鎖が構造をとっていない状態に対して自由エネルギーが十分に低い構造をとり、かつ、不活性状態と活性状態さらにはその中間状態の間での自由エネルギーの差を互いに遷移可能な程度に十分小さくするという、極めて困難なタンパク質設計に取り組む必要があったところ、LOCKRによって、アロステリック機構と同等の機能を実現した。
Nature姉妹論文
  1. 設計論文 "De novo design of bioactive protein switches" Langan RA, Boyken SE, Ng AH [..]  Baker D. Nature. 2019 Jul 24.
  2. 応用論文 "Modular and tunable biological feedback control using a de novo protein switch"  Ng AH [..] El-Samad H. Nature. 2019 Jul 24.

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