2019年11月

[出典] Immediate, multiplexed and sequential genome engineering facilitated by CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae. Li ZH [..] Liu M, Wang FQ, Wei DZ. 
J Ind Microbiol Biotechnol. 2019-11-25. 
 華東理工大学に新合新生物医药集团 (Hunan Norchem Pharmaceutical Co., Ltd)が加わった研究グループが今回開発したCas-3Pは、Cas9を発現するプラスミド (pCas9)一種類と、gRNA発現を担う異なる選択マーカ付き直鎖状のプラスミドバックボーン3種類 (P1, P2およびP3)を組み合わせることで、S. cerevisiaeにおいて、多重かつ連続した遺伝子ターゲッティングを実現した。
  • P1/P2/P3のセットには遺伝子ターゲッティングを終えたプラスミドを除去する仕組みを予め組み込んでおく。すなわち、P1, P2およびP3には、プラスミド除去の標的になる部位 (CS1, CS2およびCS3)を組み込み、同時に、それらを標的とするgRNA_CS1、gRNA_CS2およびgRNA_CS3を、P2、P3およびP1に組み込んでおく。
  • こうすることで、Cas9を予め発現させた細胞に、異なるgRNAとドナーDNAのカセットを順次3種類のプラスミドバックボーンと共にP1 -> P2 -> P3の順に送達するサイクルを経て、gRNAを帯びたプラスミドの構築やgRNAプラスミドの除去操作を繰り返すことなく、多重な遺伝子ターゲッティングを連続させていくことが可能になった。
  • Cas-3Pの実証実験の中では、α-ガラクトシダーゼ遺伝子の挿入とβ-カロテン合成経路構築を実現し、さらに、パチョロールの生産最適化を、プロモータの置換、3種類の遺伝子の過剰発現および4遺伝子のノックアウトにより実現した。
  • Cas-3Pによる単一、二重および三重の遺伝子ターゲッティングの効率はそれぞれ3〜4日間で75%, 36.8%および8.2%に達し、パチョロールの生産最適化は10日以内で達成された。
  • 以上、Cas-3PはS. cerevisiaeのセルファクトリ化を促進するツールである。

1. 創薬におけるCRISPR (成書*の第8章)
[出典] CRISPR in Drug Discovery. Lee CS, Luo J (Nationa Cancer Institute). In: O'Donnell JJ, Somberg JJ, Idemyor V, O'Donnell JT (eds) *Drug Discovery and Development, Third Edition. CRC Press.2019-12-10.
 イントロダクション; CRISPR/Cas9システムの発見と哺乳類遺伝子編集への展開; ゲノム編集ツールとしての (ノックアウト, 精密な遺伝子編集, CRISPRi, CRISPRa); CRISPR/Cas9スクリーンによる創薬標的発見(CRISPR KOとCRISPRiによる機能喪失, CRISPaによる機能獲得, in vivoスクリーン, 標的評価); CRISPR/Cas9の限界と改善戦略;まとめ

2.  [解説] CRISPRのオフターゲット編集の捉え方
[出典] What are off-target effects of CRISPR and why are they concerning? Burgio G. BioTechniques. 2019-11-27
 オーストラリア国立大学のGaetan Burgioが、CRISPR-Cas9のオフターゲット編集について、そもそも稀な現象でかつ予測可能であり、gRNAの最適設計、高精度版Cas9および最先端のシーケンシング技術を利用することで最小限に抑制可能であることから、"off-target effects are not such a concern"とし、利用目的から許容されるオフターゲット作用のレベルを見極めて、CRISPR遺伝子編集技術が適切か判定するのが重要とした。

3. CRISPR-Cas9によるインスリン様成長因子1 (IGF1)遺伝子の多重なアイソフォームの発現亢進を介して筋分化を促進
[出典] CRISPR-Cas9–induced IGF1 gene activation as a tool for enhancing muscle differentiation via multiple isoform expression. Roberston MJ [..] McConnell BK, Schwartz RJ. FASEB J. 2019-11-25
 IGF1/lgf1遺伝子は、組織発現や機能が異なる複数のタンパク質アイソフォームをコードしている。University of Houstonを主とする研究グループは今回、CRISPR-Cas9遺伝子活性化システムにより、ヒトまたはマウスの骨格筋芽細胞においてIGF1またはIgf1の一連のmRNAsの発現を上方制御することで、IGF1シグナル伝達が亢進することを示し、骨格筋萎縮の治療法としての可能性を示した。

4.  レンチウイルスで単一のCRISPRi (sgRNA-Cas9-KRAB)をマウス受精卵前核に導入することで、マウス内在遺伝子の機能喪失実験が可能になる
[出典] Effective CRISPR interference of an endogenous gene via a single transgene in mice. MacLeod RS [..] O’Brien CA. Sci Rep. 2019-11-21
 University of Arkansas for Medical Sciencesの研究グループは、その欠失または変異が大理石骨病とリンパ節の欠失をもたらすTnfsf11遺伝子をモデルとして、表題を検証した:CRISPRiトランスジーンの高発現マウスでは大理石骨病の病態とリンパ節欠失が見られ、低発現マウスは野生型と変わらず、発現レベルが中間的なマウスでは表現型も中間的となる;CRISPRiトランスジーンの組織発現とTnfsf11 mRNAレベルが逆相関する。

5. CRISPRitz: CRISPRシステムのオフターゲット部位をgRNA配列に対するindelsや変異も考慮しつつ高速に予測するソフトウエアパッケージ
[出典] CRISPRitz: rapid, high-throughput, and variant-aware in silico off-target site identification for CRISPR genome editing. Cancellieri S [..] Pinello L. Bioinformatics. 2019-11-25
 既存のオフターゲット部位in silico探索プログラムは、計算効率、標的部位における変異の評価またはアノテーション参照、オフターゲット編集が及ぼす影響評価などに限界がある。University of VeronaとMassachusetts General Hospitalの研究グループは、効率的なデータ構造とマルチコアを活かした並列計算に基づいた高速・高信頼性・悉皆的探索を介してオフターゲット部位を網羅的に推定するソフトウェアパッケージ CRISPRitz を開発し、GitHubサイトから公開した
 CRISPRitzはオフターゲット部位推定にあたって、gRNAと対合するゲノム領域における挿入・欠失 (DNA/RNA bulges)と変異を評価に入れ、利用者が指定可能な任意のサイズのミスマッチに対応し、また、コーディング・ノンコーディングの領域を問わず推定部位のゲノムアノテーションを分析しグラフ化して表示する。

6. CRISPR-Cas9で作出したF508del CFTRはCFTR機能喪失 (CFTR KO) モデルとして利用可能
[出典] Characterization of two rat models of cystic fibrosis—KO and F508del CFTR—Generated by Crispr‐Cas9. Dreano E [..] Chanson M, Cottart CH. Animal Model Exp Med. 2019-11-25
 両モデルとも浸透圧性緩下剤を伴う特別な食餌を用意することで部分的に改善される腸閉塞を起こし、また、輸精管無形成や歯のエナメル質形成不全といったCFの症状を呈した。腸、膵臓、肝臓および肺は、組織学的には異常がなかった。KOラットはCFTRの機能を喪失していたが、F508del CFTRラットには残余しているCFTRの活性が見られ、その初代培養細胞にVX-809 Lumacaftor)とVX-770 (Ivacaftor)投与するとCFTRを介したCl−イオンの輸送が改善することを見出した。

7.  [成書**の一部] iPSCのCRISPR/Cas9編集は、嚢胞性線維症 (CF)の療法足り得るか?
 CF臨床研究と療法開発の観点から、iPSCモデル、自家細胞療法ならびにin vivo遺伝子編集について考察。

8. Cas9ヌクレアーゼの精製を容易にするペプチドリガンドの開発と評価
[出典] Discovery and evaluation of peptide ligands for selective adsorption and release of Cas9 nuclease on solid substrates. Day K [..] Menegatti S. Bioconjug Chem. 2019-11-22
 E. coli 細胞溶解液に打ち込んだCas9ヌクレアーゼのリガンド候補となるペプチドを介したレジンに対する吸着と遊離を評価し、Cas9のRecIIドメインに結合する2種類のペプチド (GYYRYSEYとYYHRHGLQ)が有用であることを同定した。

出典
  • [論文] Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2. Gleizer S [..] Milo R. Cell. 2019-11-27.
  • [PREVIEW] Escherichia coli in Auto(trophic) Mode. Erb TJ, 0Keller P, Vorholt JA. Cell. 2019-11-27
  • [NEWS] E. coli bacteria engineered to eat carbon dioxide. Callaway E. Nature. 2019-11-27
  • [crisp_bio追記 2019-12-17] 酵母もオートトロフ化されたThe industrial yeast Pichia pastoris is converted from a heterotroph into an autotroph capable of growth on CO2. Gassler T [..]  Mattanovich  D, Steiger MG. Nat Biotechnol. 2019-12-16
炭素循環 [本項は原論文には詳述されていないcrisp_bio挿入分]
  • 気象庁のWebページ「二酸化炭素濃度の経年変化」によると、大気中の二酸化炭素量は、工業化 (1750年)以前の平均値とされる278 ppm (0.0278%)から2018年に世界平均で407.8 ppm (~0.0408%)へと47%増加し、また、気象庁が綾里、南鳥島及び与那国島にて測定したデータでも2019年に0.041%を超えた。
  • 地球温暖化説に対して賛否あり、大気中の二酸化炭素量が「3~4 % を超えると頭痛・めまい・吐き気などを催し、7 % を超えると炭酸ガスナルコーシスのため数分で意識を失う」に到るには進化的時間スケールを要すると思われるが、といって、二酸化炭素量の継続的上昇を放置して良いものでも無い。
  • 地球規模の人口増 (1975年 ~41億人; 2018年 ~76億人)と工業化の広がりを経ても濃度~0.04%に止まっているのは、大気圏内の炭素循環が回っているからである。この炭素循環を維持するには、人工的な二酸化炭素産生を抑制し、大気中の二酸化炭素を人工的に固定し分解あるいは変換を、促進することが必要である。
  • 生物界は、数億年の進化を経て、二酸化炭素を栄養源としてエネルギーや食糧の資源となるバイオマスに変換するオートトロフ (autotrophs: 独立/無機・栄養生物)と、有機化合物を栄養源とするヘテロトロフ (heterotrophs: 従属/有機・栄養生物)に、大別されるに至った。そこで、大気中の二酸化炭素量を制御する戦略の一つとして、植物、光合成細菌、化学合成細菌などのオートトロフ生物資源の保護・拡充が挙げられる。
研究成果
 二酸化炭素排出抑制も熱帯雨林の保護もままならぬ中、Weizmann Institute of Scienceの研究グループは今回、in silico解析から始まり遺伝子工学に進化工学を組み合わせることで、糖と多炭素化合物を栄養とするヘテロトロフ微生物である大腸菌を、二酸化炭素を唯一の栄養源としてバイオマス(*)を産生するオートトロフ微生物へと転換し、大腸菌を介して二酸化炭素をバイオマスへと変換する戦略の可能性を示した (* 2006年に閣議決定された「バイオマス・ニッポン総合戦略 」では、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」と定義されている)
  • 研究グループは、光合成反応における代表的な炭酸固定反応であるカルビン・ベンソン回路  (Calvin-Benson-Bassham, CBB)に替わり二酸化炭素を固定することを目的として、二酸化炭素から電気化学的に合成可能なギ酸塩 (formate; メタン酸塩)酸化モジュールの組み込みを試みた (モデル図として原論文Figure 1引用下図参照)。Fig. 1
  • 化学量論的in silico解析では、、メチル栄養細菌Pseudomonas sp. 101由来のNAD+に共役するギ酸デヒドロゲナーゼ (formate dehydrogenase, FDH)、CBB回路において二酸化炭素を固定化する酵素であるRubisCO、およびホスホリブロキナーゼ (Prk)の3種類の酵素を組み込むことで、大腸菌のオートトロフ化が進むとされたが、3酵素を組み込んだだけでは、大腸菌はオートトロフ化しなかった。
  • [本段落について、原論文Figure 2引用下図参照] FIg. 2
    そこで、 はじめに、解糖系のホスホフルクトキナーゼ (Pfk)と酸化的ペントースリン酸経路のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (Zwf)をノックアウトすることで、大腸菌がキシロース培地にてRubisCOを介したキシロースのカルボキシル化に依存して増殖するように設定した。次に、外因性のRubisCO、Prk、二酸化炭素を重炭酸塩を相互変換する炭酸脱水酵素(carbonate dehydratase, CA) 、およびFDHを発現させた。続いて、キシロースを制限しつつ、過剰なギ酸塩と二酸化炭素を10%含む空気を供給するケモスタットで培養を続けた。その結果、ケモスタットでの培養~200日 (~150世代に相当)で、キシロースを含まない培地での生育を観察し、~350日で全ての菌株がキシロース非依存/二酸化炭素依存になることを見出した。こうして、二酸化炭素を唯一の炭素源とし、FDHを介したギ酸塩の酸化をエネルギー源とする大腸菌株を得た
  • 研究グループは、ケモスタット由来の数クローンのゲノム解析から、指向性進化の過程で変異した遺伝子として、CBB関連遺伝子 5種類 (Category 1)、実験室内での大腸菌指向性進化実験で変異がよく見られる遺伝子 6種類 (Category 2)、および、クローンに依存して変動し機能未知の遺伝子 2~27種類 (Category 3)を同定した(原論文Figure 4引用下図参照)。FIg. 2

[出典] [NEWS & VIEWS] Three is a charm for an antibody to fight cancer/Trispecific antibodies offer a third way forward for anticancer immunotherapy. Garfall AL, June CH. Nature. 2019-11-21.; [論文] Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation. Wu L, Seung E [..] Yang Z, Nabel GJ. Nature Cancer. 2019-11-18.
[crisp_bio注] 本記事は主として NEWS &VIEWS に準拠
概要
 HIVに対する三重特異性 (trispecific)抗体を2017年に発表した (Science, 2017 )サノフィは今回、骨髄腫細胞表面に発現するCD38抗原、T細胞表面に発現するCD28抗原とCD3タンパク質複合体の3種類の分子を標的とする三重特異性抗体 (以下、CD38/CD3×CD28抗体)を開発し、効果的な抗腫瘍性を発揮することを、Nature Cancer誌に発表した

背景と詳細

[一重特異性抗体 (モノクローナル抗体)]
 モノクローナル抗体医薬品は多数認可され、多発性骨髄腫に対しても、CD38抗原を標的とするダラツムマブ/Daratumumab (商品名 ダラザレックス)が再発または難治性および未治療患者への適用を認可されている。なお、CD38は、急性リンパ性白血病や急性骨髄性白血病などの癌細胞にも発現している。

[二重特異性抗体]
 二重特異性抗体は、通常、癌細胞表面抗原CD3タンパク質複合体を標的とする。CD3はT細胞受容体 (TCR)の一部であり、TCRは、抗原認識ドメインを帯び、抗原に結合することで、活性化シグナルをT細胞内へ伝える。こうして、二重特異性抗体は、T細胞に内在している抗原特異性とは独立に、T細胞を癌細胞に近接させつつ、T細胞の抗腫瘍性を発揮させる。
 癌細胞のCD19とCD3を標的とする二重特性抗体のブリナツモマブ (商品名 ビーリンサイト )は、進行したB細胞急性リンパ芽球性白血病 (B-ALL)患者の寛解率と生存率を向上し、B-ALLの初期治療の治験が進んでいる (Blood, 2018)。

[CD38/CD3×CD28抗体]
 CD38/CD3×CD28抗体は、CD38とCD3に加えて共刺激受容体の一種であるCD28を標的に加えた。T細胞はTCRを介して標的抗原を認識し、共刺激受容体の補助を得て、免疫応答に効果的な増幅を持続する。共刺激の機序が存在しないと、TCRを介して長期間抗原に暴露されたT細胞はanergy (アネルギー)またはexhasution (疲弊)と呼ばれる免疫不応答の状態に陥り、アポトーシスに至る。
 共刺激受容体をT細胞の活性化に利用する戦略は、癌細胞に発現している抗原と共に、CD3やCD28といったT細胞活性化ドメインも認識するように改変したキメラ抗原受容体を備えたT細胞 (CAR-T細胞)による癌免疫療法に生かされている。しかし、多発性骨髄腫に対する完全長B-Cell Maturation Antigen(BCMA)を標的とするCAR-T療法の効果は短期的である (NEJM, 2019)ことから、新たな療法が求められている。
 CD38/CD3×CD28抗体がCD28を標的とした効用は、T細胞活性化に加えて、骨髄腫細胞への結合親和性の向上もある。CD28は多発性骨髄腫細胞で高頻度に発現していることが知られていたが、今回、CD38とCD28の発現レベルが異なる3種類の多発性骨髄腫細胞での検証実験から、CD28が三重特異性抗体の骨髄腫細胞への結合親和性を高め、CD38の発現が弱い骨髄腫細胞に対する効果を高めることを同定した。

[CD38/CD3×CD28抗体の効用]
 ヒトT細胞とヒト骨髄腫細胞を帯びたヒト化モデルマウスにおいて、3種類の分子を標的とする3種類のドメインを変異させた(*)CD38/CD3×CD28抗体の効果を比較し、CD28を標的とするドメインの存在によって、T細胞の活性と増殖、および抗アポトーシス性タンパク質Bcl-xLの発現が亢進することを同定した。
 また、in vitroにて、CD28を標的とするドメインを帯びたCD38/CD3×CD28抗体が骨髄腫細胞株を効果的に細胞死へと誘導することも確認した。また、CRISPR-Cas9を介してCD28をノックアウトしたKMS-11細胞 (KMS-11 KO細胞) のCD38/CD3×CD28抗体による溶解性が、元のKMS-11細胞の10~100分の1に低下することも同定した。

[CD38/CD3×CD28抗体の構造] 
 2つの三重特異性抗体がT細胞表面に沿って、T細胞表面上でダイマーを形成している各CD28にそれぞれ結合することを同定した (原論文 Fig. 6参照):6O89 Anti-CD28xCD3 CODV Fab (分解能 2.09 Å); 6O8D Anti-CD28xCD3 CODV Fab bound to CD28  (分解能 3.547 Å)

[CD38/CD3×CD28抗体の課題]
 免疫システムの活性化に伴うリスクであるサイトカイン放出症候群について、研究グループは、サルを対象として、皮下注射によって静脈注射の場合よりも緩和されると報告したが、サルでの結果がヒトに外挿できるか検証が必要である。また、CD38/CD3×CD28抗体の分解をもたらす抗体自身に対するヒトの免疫応答についての検証も必要である。

[出典] Multiplex nucleotide editing by high-fidelity Cas9 variants with improved efficiency in rice. Xu W, Song W [..] Yang J. BMC Plant Biol. 2019-11-21.
 北京市農林科学院の研究グループは今回、SpCas9および3種類の高精度版SpCas9 (eSpCas9(1.1) [1]; SpCas9-HF2 [2]; HypaCas9 [3])に、ラットまたはウミヤツメのシチジンデアミナーゼ (rAPOBEC1またはPmCDA1[4]) を組み合わせたrBEまたはpBEと、tRNA-sgRNAの多重コンストラクトを利用して、イネにおける多重な塩基編集 (BE)の効率とオフターゲット頻度を評価した (SpCas9版rBEとpBEおよびtRNA-sgRNAのコンストラクトについて、Fig. 1から引用した下図 a 参照)。rice BE 1
SpCas9および高精度版SpCas9いずれについても、イネにおけるC-to-Tの変換効率はpBEがrBEを大きく上回った (上図 b 参照)
 また、複数遺伝子を標的とするgRNAsをtRNAを介して直列に結合したコンストラクトを組み合わせることで多重遺伝子編集が実現するが、gRNAを改変することで (Fig. 2引用下図 b 参照)、rice BE 2
高精度版SpCas9に基づくpBEの変換効率が向上し (上図 c 参照)、特に、eSpCas9(1.1)-pBEの場合は著しく向上した (下図 c 参照)。改変gRNAは、高精度版SpCas9のノックアウト活性も1.7~2.3倍向上させた (上図 d 参照)
 変換効率の観点でからは、eSpCas9(1.1)が最も優れており、編集の精度 (オフターゲット抑制)の観点からは、SpCas9-HF2またはHypaCas9に基づくpBEが優れていた。

[参考crisp_bio記事]
[1] CRISPR関連文献メモ_2015/12/02 [第1項] "eSpCas9": Cas9/sgRBA/標的DNA三者複合体の構造に基づいて、オフターゲット編集を検出限界以下まで抑制するCas9変異体を作出
[2] CRISPRメモ_2018/06/08 [第1項] [特許公開]レポータCas9変異体 (HypaCas9)とその利用法

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