2020年01月

1. [レビュー] 1981年に初めて定義されたエンハンサー、2021年の定義が必要とするいう思いを込めたレビュー
[出典] Towards a comprehensive catalogue of validated and target-linked human enhancers. Gasperini M, Tome JM, Shendure J. Nat Rev Genet. 2020-01-27 [9ページ/244文献]. 
  • ヒトゲノム内のエンハンサーを同定、検証そしてまたは特徴づける多彩な技術の最新動向をレビューし、レポータを利用したアッセイ、生化学的測定およびCRISPRスクリーンからの多相かつ相補的なデータを包含するエンハンサーの定義をもたらすフレームワークを提案
  • Table 1に、表題手法16種類について利点と弱点がまとめられている。CRISPR技術については、単一遺伝子のスクリーンと、トランスクリプトームを対象とするCRISPRスクリーンの2種類の手法として取り上げられている。
  • テキスト中ではCRISPR ko/i/a; scRNA-seqとの組み合わせ(Perturb-seq; CRISP-seq; CROP-seq; Mosaic-seq)が取り上げられている。
  •  (*)関連crisp_bio記事: 2019-06-05 scMAGeCK:CRISPRスクリーンとscRNA-seqの結果から多重なフェノタイプと相関する遺伝子群を同定CRISPR関連文献メモ_2016/12/19 - Perturb-seq,  CRISP-seq, CROP-seq
2. インターロイキン-1の刺激がもたらすクロマチン・アクセシブリティー・ランドスケープの変化
[出典] Dynamic chromatin accessibility landscape changes following interleukin-1 stimulation. Barter MJ, Cheung K, Falk J [..] Young DA. [Newcastle U.] bioRxiv 2020-01-30
  • IL-1の刺激により開くクロマチン領域とそこに結合する転写因子をATAC-seq, モチーフ探索およびChIP-seqで絞り込み、遺伝子発現調節機能をCRISPR KOとCRISPRaで同定
3.  植物ゲノム編集に最適なgRNA設計支援ツールを開発することが必要である - 動物実験に基づくツールは不適
[出典] Are the current gRNA ranking prediction algorithms useful for genome editing in plants? Naim F [..] Waterhouse PM. [Queensland U. Technologyなど] PLoS One 2020-01-24
  • 8種類のオンラインgRNA設計支援ツールを評価し、ランキング結果がほとんど整合せず、in vivo実験からの評価結果との間に有意な相関を見いだせなかった (Fig. 4 (C)引用下図参照)。gRNA for plants
4. [レビュー] 神経科学における光遺伝学技術とヒトPSCからの脳オルガノイド技術の融合をテーマとするレビュー: 光によるCRISPR-Cas9の活性制御技術 (*)について1節を費やしている
[出典] New Pioneers of Optogenetics in Neuroscience. Somuncu ÖS, Berns HM, Sanchez JG. In: Advances in Experimental Medicine and Biology. 2020-01-26

(*) 例示関連crisp_bio記事
5. EUが"生殖細胞系列系の'遺伝的同一性'を改変する臨床試験を禁止したのを受けて、616編の文献を解析し、'遺伝的同一性'が多様な概念、場合によっては、相反する概念を示しているとし、'遺伝的同一性'の定義が必要と主張
[出典] Systematic scoping review of the concept of ‘genetic identity’ and its relevance for germline modification. Goekoop FM [..] Evans N [Amsterdam AMC] PLoS One 2020-01-24

6. [特集号]CRISPRbabiesが提示した生殖細胞系列のゲノム編集の受け止めに関する考察
  • Perspectives in Biology and Medicine, volume 63, number 1  (winter 2020)のプレプリント (2020-01-25 MUSE Webサイトから公開)
  • Introduction to the Special Issue on CRISPR. Daley GQ*.  [Harvard Medical School]: 著者はCRISPRbabiesが話題をさらったヒトゲノム編集第2回国際サミット (香港)の組織委員会委員の一人
 例えば:

[crisp_bio注]「CRISPRメモ」を文献リストとしては維持しつつ、簡略化を模索中です。コメントよろしくお願い致します。なお、現時点でも「CRISPRメモ」はCRISPR関連論文の悉皆的リストとはなっておりません。

[crisp_bio注] 第2項と第3項は2019年論文と2017年論文が対象

1.  FnCas12aのgood gRNAとbad gRNA
[出典] Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Creutzburg SCA [..] der Oost JV.  [Wageningen U.とU. Copenhagen] Nucleic Acids Res 2020-01-28
 FnCas12aの活性はcrRNAの2次構造に左右される; E. coli in vivoでのアッセイ系で測定; 効率的ターゲッティングにはgRNA (crRNA)と標的鎖の間の19-ntの結合で十分; gRNA20th-ntからの3'末端の設計により非効率なgRNAを高効率なgRNAに改変可能 (Figure 5引用下図参照)bad & good gRNA
[参考] Cas12a (Cpf1)活性のin silico予測
  • CRISPRメモ_2019/06/19-1 [第3項] 深層学習によりCRISPR-Cpf1のオンターゲット編集活性とオフターゲット編集発生を予測
  • CRISPRメモ_2018/02/04 [第3項] CRISPR-Cpf1 gRNA活性予測精度を、深層学習(deep learning)により向上
2. iRS細胞からiPS細胞への再プログラム過程可視化
[出典] Visualization of sequential conversion of human intermediately reprogrammed stem cells into iPS cells. Teshigawara R, Hirano K, Nagata S, Huang D, Tada T [京大]. Genes Cells. 2019 Oct;24(10):667-673. Online 2019-09-01
 OCT4, TDGF1およびE‐CADHERINをマーカ遺伝子として単一細胞マイクロアレーにより再プログラムに伴う遺伝子発現プロファイルの変化を追跡; OCT4関連75遺伝子の中から、LIN28 (LIN28A)とFOXO1をCRISPR/Cas9で標識し可視化し、OCT4が両者の活性化に必須と同定

3. ATAC-seqからミトコンドリアDNA (mt-DNA)由来リードを低減
[出典] Reducing mitochondrial reads in ATAC-seq using CRISPR/Cas9. Montefiori L [..] Nobrega M, Jo Sakabe N. [U. Chicago, Duke U.] Sci Rep. 2017-05-26. 
 ATAC-seqサンプル由来のリードの~20-80%はmtDNA; CRISPR/Cas9によるmtDNA切断を介してmtDNAシーケンシングの無駄を無くしATAC-seqを効率化

[出典] Tandem Paired Nicking Promotes Precise Genome Editing with Scarce Interference by p53. Hyodo T [..] Konishi H. Cell Rep 2020-01-28. (bioRxiv. 2019-10-18);愛知医科大学に遺伝研先端ゲノミクス推進センターが加わった研究グループの成果

 “tandem paired nicking” はLeiden University Medical Centerの研究グループの2017年のNature Communication論文のSupplementary Figure 6から引用した下図 aにあるように、ノックイン標的サイトを囲む同一DNA鎖上の2ヶ所を標的とする1対のCas9ニッカーゼによって標的DNA鎖の2ヶ所にニックを入れると同時に、ノックイン用ドナープラスミドの相同アーム上の標的DNA鎖と同一位置2ヶ所にもニックを入れる (isolocal nicking)手法である。Supplementary Figure 6
上図の b は、Cas9による二本鎖DNA切断 (DSB)からのHDRを介したノックイン、標的(target)とドナー(donor)の双方にニックを入れるNick2、標的にだけニックを入れるsingle nick、tandem paired nicking (Tandem Nick2)によるノックイン結果の比較図である。その中でTandem Nick2のバーのマゼンタ色とシアン色はgRNAの内向きと外向きに相当する。研究グループは、先行研究よりも幅広い細胞株と遺伝子座について、“tandem paired nicking (以下、TPN)”の性能を評価した。

 研究グループは今回、HCT116, DLD-1, MCF10A, HeLa、293T、ヒトiPSCなどの細胞株における複数の遺伝子座を標的として“tandem paired nicking (以下、TPN)”によるノックインを試み、ノックイン効率とノックインに伴うindelsの発生およびオフターゲット編集を検証した。さらに、これまでCas9ヌクレアーゼHDRを介したゲノム編集との相関について議論が続いているp53とTPNとの相関についても検証した。
  • TPNのノックイン効率は、Cas9 HDRを介したノックインと同レベルである。また、特に大規模なノックインにおいて、単一のニッキングを介したノックインを遥かに凌ぐ効率を実現する。
  • TPNのノックイン効率は、相同アームの長さに左右され、これが、先行研究でTPNの効率が相対的に低く見えた原因と考えられる。また、Cas9 ヌクレアーゼ HDRとは異なり、ノックインサイトとニッキングサイトの間が416 bpまで離れていても、ノックイン効率が維持される。
  • TPNは、ホリデーモデルに似たDNAの相同組み換えを介して、目的以外のサイレント突然変異のような塩基改変を誘導することなく、目的のノックインを実現する。
  • TPNはまた、ノックイン標的サイトにindelsをほとんど誘導せず、また、ドナープラスミド全体のノックインを引き起こさない。
  • TPNは、p53の活性化を誘導することなく、また、p53の抑制にも左右されない。
 [関連crisp_bio記事]
  1. CRISPRメモ_2017/12/27-2 [第12項] 二本鎖DNA切断を経ない精密かつ高効率な遺伝子編集の新たな手法 (Nishijima K et al., 2017)
  2. CRISPRメモ_2017/09/23 [第2項] 標的DNAとHR用テンプレートDNAに同時にニックを入れることで、二本鎖切断を介さずシームレスなゲノム編集を実現 (Chen X et al., 2017)

[出典] Terminating contamination: large-scale search identifies more than 2,000,000 contaminated entries in GenBank. Steinegger M, Salzberg SL. bioRxiv. 2020-01-26.

 メタゲノムシーケンシングから環境中の生物の組成を知るには、分類群が特定されている参照配列が必須である。JHUの研究チームは今回、NCBIが提供している配列データベースについて全配列-対-全配列を悉皆的に比較することで、ラベルされた生物種に誤りがある配列を効率的に検出・除去するプログラム、Conterminator、を開発・実行・公開した。ソースコードはGitHubサイト"Detection of incorrectly labeled sequences across kingdoms"から公開されている。
  • GenBankには500,000件を超えるゲノム配列が蓄積されてきたが、その殆どは、完全ゲノムに達していないドラフトゲノム配列であり、このドラフトゲノム配列には、ラベルされている生物種とは異なる生物種のDNAがcontaminants (コンタミ配列)として、配列決定の過程で紛れ込んだ可能がある。
  • NCBIではVecScreenで合成配列を検出・除去し、BLASTアラインメントでよく見られるコンタミ配列を検出・除去しているが、それでもコンタミ配列の混在が指摘されている。
  • 今回論文の著者の一人であるSalzbergのグループは、バクテリアとアーケアとされているドラフトゲノム配列のうち、2,250ゲノムがヒト由来であり、その多くが自動アノテーションを介してバクテリアとアーケアのタンパク質として登録・公開されていることを指摘していた (Genome Research, 2019 [1])。
  • ゲノムシーケンシングの現場には常にヒトが存在するために、ヒトゲノム配列がコンタミネーションの主犯であり続けている。加えて、その他の生物種間のゲノム配列のコンタミも知られている。
  • コンタミが2次コンタミを引き起こすことがないように、コンタミ配列を網羅したいところであるが、単純なアラインメントでは非現実的な計算コストがかかることになる。NCBIのRefSeqデータベースのサイズは~1.5 Tbであり、全配列についてall-against-all BLASTアライメントしようとすると、その計算コストは~30,000 CPU年 と試算される。
  • Conterminatorは、all-against-allの比較を計算時間が入力データサイズとともに線形に延びていくプログラムLinclust (Nat Commun, 2018 [2])につづいて並列化アライメントプログラムMMseqs2 (Nat Biotechnol, 2017 [3])を走らせる。
  • Conterminatorを32コア/メモリー2TBのコンピュータで走らせて、GenBankデータベースRefSeqデータベースを解析した。それぞれのデータベースの規模、計算に要した日数、コンタミ配列件数とコンタミ配列の影響を受けた生物種数はそれぞれ以下の結果となった:
  1. GenBank: 3.3 Tb、12日、2,161,746 配列、6,795 生物種 (95%が真核生物ゲノム);全データからみるとその比率はかなり低いとも言えるが、公共データベースを参照することで、誤った結論に至るリスクが潜在することになる。
  2. RefSeq: 1.5 Tb、5日、114,035 配列、2767 生物種 (52%が真核生物ゲノム)
  3. [注] コンタミ配列をもたらした生物種はGenBankとRefSeqでそれぞれ13,981種と2,881種類であり、ヒト, Saccharomyces cerevisiae, Stenotrophomonas maltophiliaおよびSerratia marcescensが上位に来た。
  • 高品質とされるゲノム配列であるFDA-ARGOS (Nat Commun, 2019 [4])の微生物ゲノム928配列と、モデル生物 (S. cerevisiae, Danio rerio, Mus musculusDrosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans)、およびヒトの完全ゲノムについてもコンタミ配列の同定を試み、ヒト完全ゲノムにAcidithiobacillus thiooxidans配列を、Caenorhabditis elegans完全ゲノムにE. coli配列を検出した。
  • タンパク質配列については、まず、RefSeq内のコンタミ配列の19.4% (47,943配列)にタンパク質がアノテーションされていた。そこで、NR (非冗長タンパク質配列データベース)についてクラスターの均一性から判定する手法を組み入れて、14,132件をコンタミ・タンパク質配列とし、その中で7,359件はUniProtデータベースにも連鎖しているとした。
 [引用文献リスト]
  1. Human contamination in bacterial genomes has created thousands of spurious proteins. Breitwieser FP, Pertea M, Zimin AV, Salzberg SL. Genome Res. 2019 Jun;29(6):954-960. Online 2019-05-07
  2. Clustering huge protein sequence sets in linear time. Steinegger M, Söding J. Nat Commun. 2018 Jun 29;9(1):2542
  3. MMseqs2 enables sensitive protein sequence searching for the analysis of massive data sets. Steinegger M, Söding J. Nat Biotechnol. 2017 Nov;35(11):1026-1028. Online 2017-10-16.
  4. FDA-ARGOS is a database with public quality-controlled reference genomes for diagnostic use and regulatory science. Sichtig H, Minogue T et alNat Commun. 2019 Jul 25;10(1):3313

[crisp_bio注] 「CRISPRメモ」を文献リストとしては維持しつつ、簡略化を模索中です。コメントよろしくお願い致します。なお、現時点でも「CRISPRメモ」はCRISPR関連論文の悉皆的リストとはなっておりません。

1. ニワトリ; トリ白血病ウイルス(ALV-J)の宿主因子NHE1のW38を、始原生殖細胞にてCRISPR-Cas9 HDRを介して削除することでニワトリにALV-J耐性付与[Institute of Molecular Genetics, BIOPHARM (チェコ)]
[出典] Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Koslová A [..] Hejnar J. Proc Natl Acad Sci U S A 2020-01-21. 

2. ウサギ; シチジンデアミナーゼへの変異導入により 編集ウインドウを3-ntまで縮小した高精度YFE-BE4max作出 [吉林大学]
[出典] Efficient base editing with high precision in rabbits using YFE-BE4max. Liu Z [..] Lai L, Li Z. Cell Death Dis. 2020-01-20.

3. ゼブラフィッシュ;ヒト癲癇関連遺伝子に相同なeef1a2のヌル変異は寿命に影響しない  [エジンバラ大学]
[出典] Translation elongation factor 1A2 (eEF1A2) is encoded by one of four eef1a genes and is dispensable for survival in zebrafish. Idigo NJ, Soares DC, Abbott CM. Biosci Rep. 2020-01-17

4. ゼブラフィッシュ; HDR用テンプレートとして長いssDNA (lssDNA)を使用することで効率的に精密編集可能とするzLOST法を開発しヒト疾患モデルも作出 [華南師範大学, 北京大学]
[出典] CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. Bai H [..] Liang F, Qin W. BMC Genomics 2020-01-21
 zLOST: zebrafish long single-stranded DNA template

5. マウス; ALS患者由来変異をノックインしたモデルにスプライシング異常が誘導されたが神経変性には至らなかった [名古屋大学・理研]
[出典] ALS-linked TDP-43(M337V) knock-in mice exhibit splicing deregulation without neurodegeneration. Watanabe S [..] Yamanaka K. Mol Brain 2020-01-20

6. ラット; 痛み・痒み・喘息モデル作出の観点からTRPA1をノックアウト; 痛みと痒みへの応答は野生型と変わらず; 喘息治療の標的の可能性あり [ジェネンテック]
[出典] Behavioral characterization of a CRISPR-generated TRPA1 knockout rat in models of pain, itch, and asthma. Reese RM, Dourado M [..] Hackos DH.Sci Rep 2020-01-22

7. ゴールデンリトリーバーDMDモデル; CRISPR-Cas9とTALENのHDRを介した遺伝子治療; in vitro -  タンパク質発現に至ず; in vivo - タンパク質発現Cas9で数%/TALEN無し; 組織病理学および機能の改善見られず、遺伝子修復の効率向上とタンパク質発現に向けた研究開発が必要 [Texas A&M Universityなど]
[出典] Challenges associated with homologous directed repair using CRISPR-Cas9 and TALEN to edit the DMD genetic mutation in canine Duchenne muscular dystrophy. Mata López S [..] Nghiem PP. PLoS One. 2020-01-21

8. ヒト細胞とマウス細胞; AID法改変;AID-タグとオーキシン受容体TIR1の結合親和性を1000倍以上高める改変を施し、細胞障害性が高いオーキシンの必要濃度を~1,000分の1に低減することで、脊椎動物細胞におけるAIDの可用性を高めた [阪大, 名大など]
[出典] A super sensitive auxin-inducible degron system with an engineered auxin-TIR1 pair. Nishimura K [..] Fukagawa T. bioRxiv 2020-01-20.
9. 三次元培養HEK293細胞;  dCas9-(メチル化/脱メチル化酵素のドメイン)よるエピゲピゲノム編集が有糸分裂に与える影響を光シート顕微鏡diSPIM [*]で解析 [ハイデルベルグ大学など]
[出典] Automated screening by 3D light-sheet microscopy with high spatial and temporal resolution reveals mitotic phenotypes. Eismann B, Krieger TG [..] Eils R, Conrad C. bioRxiv. 2020-01-20.  
  [*] diSPIM (YouTube解説ビデオ)

10. Cas9/sgRNA RNPのナノ粒子による効率的デリバリー; ヒドロキシステアリン酸を含むlipo-OAA (脂質を含むoligoaminoamides)を利用 [ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン]
[出典] Delivery of Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complexes via Hydroxystearyl Oligoamino Amides. Kuhn J [..] Lächelt U. Bioconjugate Chem. 2020-01-22

11. 特許公開; レーバー先天性黒内障の治療 [EDITAS Medicine]
[出典] Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10). US20200017849A1

12. 特許公開; 疾患遺伝子編集に向けたヒト3次元神経組織構築法 [ブロード研/MIT]
[出典] Three-Dimensional Human Neural Tissues for CRISPR-Mediated Perturbation of Disease Genes. Halil Tekin, Feng Zhang. US20200018746A1 2020-01-16.

13. 特許公開; AAV-CRISPRを介したin vivoスクリーニングで、癌ゲノムアトラスに腫瘍抑制因子をマッピング [イェール大学]
[出典] Mapping a Functional Cancer Genome Atlas of Tumor Suppressors Using AAV-CRISPR Mediated Direct In Vivo Screening. US20200017917A1

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