[出典] Dynamic Imaging of RNA in Living Cells by CRISPR-Cas13 Systems.Yang LZ, Wang Y [..]  Chen LL. Mol Cell 2019-11-9. > 2019 Dec 19;76(6): P981-997.E7.
[# 2020-01-17追記] [SPOTLIGHT] Put on Your Para-spectacles: The Development of Optimized CRISPR-Cas13-Based Approaches to Image RNA Dynamics in Real Time. Davis BJ, O’Connell MR. Mol Cell. 2020-01-16.

 生細胞内でのRNA可視化にこれまで、MS2-MCPシステム、RNAアプタマー [1]、モレキュラービーコン [2]、RCas9 (RNA-targeting Cas9) [3]などが開発されてきたが、RNAの構造や機能への影響、煩雑な操作、経費、信頼性などの観点から一長一短であった。

 中国科学院分子細胞生物学研究所 (上海)を主とする研究グループは今回、RNAにガイドされてRNAを標的とするCRISPR-Casタンパク質であるCas13 [4-5]を利用することで、MS2-MCPシステムのように特定のDNA領域にMS2リピートを挿入するなどの遺伝子操作を必要とせず、RNA標識効率は従来の手法に匹敵する使い勝手の良い生細胞内RNA動態可視化法を実現した。
  • RNAを切断することなく標識するに最適なdCas13を同定するために、「相分離を介して核内構造体であるパラスペックルの形成をひき起こす長鎖非コードRNA」であるNEAT1を標的として、比較的多数の1細胞あたり~10-20個)パラスペックル/Paraspeckleを含みパラスペックルあたり~50-60個のNEAT1を含むHeLa細胞において、8種類のdCas13ホモログを評価し、選択性と感度の観点から、Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13bとPorphyromonas gulae (Pgu) Cas13bを選択した。
  • 続いて、dPspCas13bによるNEAT1の標識を最適化するsgRNAsを同定し、さらに3xEGFPによる標識が最も効果的であることも同定した。
  • dPspCas13b-3xEGFPにより、NEAT1の他に、SatIIIMUC4およびGCNも可視化し、パラスペックと相関するNEAT1の動態の解析が可能なことを示した。
  • また、dPspCas13b-3xEGFPとMCP-mBuby3:MS2-KIの併用、または、dPguCas13b-3 × EGFPとPspCas13b-3xEGFPの併用により、一細胞内でのRNAsの2色標識が可能なことを示した。
  • さらに、dCas13による標識とdCas9による標識を組み合わせることで、一生細胞でのRNA転写物とゲノムDNAの同時可視化も実現した。
[参考crisp_bio記事]