[出典] Efficient immune cell genome engineering with improved CRISPR editing tools. Chan W [..] Germain RN.bioRxiv 2020-02-14

 NIAID/NIHとJHUの研究グループは今回、レンチウイルスの徹底的な精製およびインテグラーゼ欠損レンチウイルスの利用、ドキシサイクリン誘導性CRISPR-Casの利用、Cas9ニッカーゼ (Cas9n)とsgRNAsペアの利用、Cas9とsgRNA双方への蛍光レポータの組み込み、抗生物質による選択用耐性遺伝子の組み込みとCre/loxPシステムによるその除去、を組み合わせることで、CRISPR-Cas9によるマクロファージの遺伝子ノックアウトおよびT細胞へのHDRを介したノックインとフェノタイピングの精度と効率を高めることに成功した。また、Cas9とsgRNAを一体化した (all-in-one) CRISPRaシステムによる遺伝子発現活性化も実現した。
  • レンチウイルスの徹底的な精製:不純物に由来する免疫細胞の細胞死を抑制
  • インテグラーゼ欠損レンチウイルスの利用:デリバリー可能な容量の拡大と、宿主ゲノムへのランダムな組み込みの回避
  • ドキシサイクリン誘導性CRISPR-Cas9 (pCW-Cas9):Cas9の恒常的発現を回避することでオフターゲット編集を抑制
  • nCas9・sgRNAsペア:オフターゲット編集の抑制
  • Cas9とsgRNAの二重蛍光レポータ:pCW-Cas9導入細胞のマーカとして利用; sgRNAのデリバリーに成功したクローンを抗生物質で選別し、続いて、Cas9の発現を誘導し、Cas9-sgRNAが活性であったクローンのFACSによる単離を実現;また、異なる蛍光標識を利用した2種類のsgRNAsを利用した多重編集へも展開
  • 抗生物質耐性遺伝子の組み込み:極めて少数 ( <0.05%または < 300個未満)のHDR成功細胞のエンリッチメントに有効
  • 抗生物質耐性遺伝子の除去:遺伝子編集の繰り返しに利用
 実証は、マウス・マクロファージのRAW264.7細胞株とマウス骨髄由来初代マクロファージにおける一連の二重特異性ホスファターゼ (DUSP)遺伝子のノックアウト、ヒトJukart-T細胞における単独ノックインと異なる遺伝子座への連続ノックインおよびCRISPRaによるPDCD1(PD1)の発現活性化、で示した。