[出典] "All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV virus" Xiong Ding, Kun Yin, Ziyue Li, Changchun Liu. bioRxiv 2020-03-21.

 UConn Healthの研究チームは今回、DETECTRと同様にCas12aのコラテラルssDNA切断活性を利用しながらも、核酸の増幅から検出までのワンポット反応 [1]と、crRNAぺアによるCas12a-crRNAの二重化 [2]による感度向上を介して、簡素、迅速、かつ超高感度であり、また視覚的判定も可能な核酸検出法を開発し、その性能をレトロウイルスのHIV-1とSARS-CoV-2を対象とするDNA/RNA検出で実証した上で、All-In-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR)法としてbioRxivに投稿した。 
  1. AIOD-CRISPRアッセイでは、核酸増幅から核酸検出までに必要な全てのコンポーネントを単一の反応装置に混合し一定温度 (37 °C)でインキュベートすることで、増幅装置と検出装置の二本立てとその間のサンプルの移動を回避している。
  2. 標的配列におけるフォワードプライマーとリバースプライマーの認識部位に近接した部位に結合するcrRNAsペアをもとにCas12a-crRNA複合体のペアを予め用意しておき、等温DNA増幅用プライマー*2を含むRPA mix, ssDNA-FQ (Fluorescence Quenching)レポーター, リコンビナーゼ, ssDNA結合タンパク質 (SSB), strand displacement活性を帯びたDNAポリメラーゼ, および標的核酸を含む溶液に投入する。
  • ワンポット反応は、RPA増幅から始まり、strand replacementを介して露出したcrRNA標的部位へのCas12a-crRNA複合体の結合を契機としてCas12aのコラテラルssDNA切断活性が発揮され、それによって切断されたssDNA-FQレポータが蛍光を発する。RPAの増幅産物も、Cas12aのコラテラルssDNA切断活性を介して、レポーターの発光に貢献する [Figure 1引用下図 A 参照]。
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  • 上図 B にあるように、全てのコンポーネントが揃った場合に限り、40分のインキュベーションを経て、青色LED光および紫外光の照射によって、レポータからの蛍光が明確に見えてくる。また、特別な光を照射しなくても、溶液の色変化を目視で判定可能であった。この結果はPAGE解析とリアルタイムの蛍光強度測定でも裏付けられた。
  • 続いて、最適化を試みる中で、2種類のcrRNAsを同時使用する効果を確認すると共に、ssDNA-FQレポーターの濃度4μM以上、フォーワードとリバースのプライマー濃度それぞれ0.32μMの条件も探り当てた。
HIV-1検出
  • AIOD-CRISPRにより、1分のインキュベーションで、HIV-1 DNA 1.2 copiesまで検出可能であった。
  • トリ骨髄芽球症ウイルス (AMV)由来逆転写酵素を介したRT-AIOD-CRISPRによりHIV-1 RNA (合成したgagの1027-nt断片)を、40分のインキュベーションで11 copiesまで検出可能であり (1.1 copiesは非検出)、血漿サンプルからの検出も、感度は低下したが、可能であった。
SARS-CoV-2検出
  • 長さ384-ntのSARS-CoV-2 N遺伝子cDNAを合成し、40分以内に1.3 copiesまで検出可能であり、また、SARS-CoVとMERS-CoVに対しては非検出になることも確認した。
  • RT-AIOD-CRISPRによるSARS-CoV-2 NのRNA遺伝子については、40分以内に4.6 copiesまで検出可能であった。
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