[出典] DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor. Lapinaite A, Knott GJ [..] Beal PA, Liu DR, Doudna JA. Science 2020-07-31.
ABEの歴史
- D. R. Liuらは2017年に、E. coli tRNAアデノシン脱アミノ化酵素 (t-RNA adenine deamninase A: 野生型TadA, WT TadA)からの研究室内進化を経てWT TadAに対して14種類の変異を帯び天然には存在しないDNA内のアデノシンを脱アミノ化する酵素 (TadA*)を得、nCas9との結合様式とリンカーの長さの最適化とWT TadA/TadA*のヘテロ二量体の利用を経て、A•T-to-G•C変換を比較的効率的に実現するABE7.10に到達、Nature誌に発表した [1]。
- 続いて、D. R. LiuらはABE7.10のオフターゲット編集を抑制したABEmax [2]を開発し、これに対して、J. K. JoungらがWT TadAを削除可能なことを見出しminiABEmax [3] に至った 。
- その後、D. R. LiuらにJ. A. Doudnaらも加わって、ABE7.10の編集効率をアデニンの脱アミノ化の高速化とエフェクターのDNAへの結合親和性を高めることで、さらに向上させることが可能という仮説にもとに研究開発を進めた。その結果、指向性進化法PACE/PANCEを介して、WT TadAに対して22種類の変異を帯びそれまでのTadA*よりも高速な脱アミノ化を実現するデアミナーゼ変異体を得、さらに、オフターゲット編集を抑制する変異も導入し、2020年3月にABE7.10の590/1170倍高速なABE8e [4; ]を、Nature Biotechnology誌に発表した。
- ABE7.10: WT TadA - TadA* - nSpCas9 (addgene 102919)
- ABE8e: TadA* - nSpCas9 (addgene 138489)
成果概要
ABE7.10に組み込まれたTadA*が帯びている変異の意味については、LiuとDoudnaらとは独立な研究グループが、分子動力学シミュレーションと実験検証にとづいて考察を加え、Science Advances誌に発表していた [5]。
J. A. Doudna, D. R. LiuにP. A. Bealらが加わったUC Berkeley, Broad InstituteならびにUC Davisの研究グループは今回、クライオ電顕単粒子再構成法と反応速度論的解析により、TadA-8eの高速塩基変換が拠って来る構造基盤を明らかにし、また、より高性能なABEを合理的に設計する手がかりを提示するに至った。
構造情報
詳細
[参考crisp_bio記事]
- ABE8eはnSpCas9に単一のTadA*を融合した構成であるが、今回、基質のdsDNAに結合したABE8eのTadA*に、そのABE8eとは異なるABE8eのTadA*がトランスに結合しTadA*二量体を形成することが見えてきた (以下, 前者をシス結合TadA*、後者をトランス結合TadA*)。
- シスTadA*は、ssDNAのNTSに結合するがSpCas9との接合面を提示せず、また、dsDNAには結合しない。一方でトランスTadA*はNTSには結合せず、SpCas9のRuvCドメインに対して非選択的接合面を提示する。また、シス-ssDNAの脱アミノ化の速度が、トランス-ssDNA脱アミノ化の~3.7倍に相当し、ABE8eが複数回反応を触媒するMultiple Turnover酵素であることをin vitroで同定した [TadA*ドメインとNTSの結合模式図, PDBから引用した右図参照]。
- ABE8eの高速化は、ABE8eの活性中心に近いに位置する変異が、その構造が柔軟なssDNAを、TadA*の狭い基質結合ポケットに入り込めるようにトランスファーRNAに似たコンフォメーションへと誘導し、拘束することで、実現されていた。
- 一方で、nSpCas9に融合したTadA*は常時活性化している。したがって、nSpCas9-sgRNAがdsDNAを走査してPAMを認識し標的部位に結合するまでに、標的部位以外の領域のDNAセグメントに次々に結合しては遊離することを繰り返す間に、高速に脱アミノ化することが、標的アデニン以外のアデニンを脱アミノ化するオフターゲット編集をもたらす。
- ABEmax: CRISPRメモ_2018/05/30 - 3 [第1項] 塩基エディターBE4とABEを、BE4max/AncBE4max/ABEmaxへと強化; 2019-05-10 ABEによる細胞内RNA編集の検証と抑制
- miniABEmax: 2019-05-11 塩基編集ABE (A-to-G)とCBE (C-to-T)のRNAオフターゲット編集を抑制
- ABE8e: 2020-03-18 Liu DRとDoudna JAら、ABE7.10をABE8eへと進化
- 2020-03-10 アデニン塩基エディター"ABE7.10"を構成するTadA*に導入された14種類の変異の意味
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