[出典] Batra R, Nelles DA ~ Yeo GW. “Elimination of Toxic Microsatellite Repeat Expansion RNA by RNA-Targeting Cas9.” Cell. Available online 10 August 2017

 

RCas9

  • Jennifer A. DoudnaUC Berkeleyチームは2014年に(O’Connell et al. Nature 2014)、PAMssRNAにトランスに供することで、dsDNAを標的とするCas9を、ssRNAの認識・切断に展開可能なことを示しこのシステムをRCas9RNA-targeting Cas9)と命名した。
  • 続いて、Gene W. YeoらのUCSDUC Berkeleyの共同研究チームが2016年に、dCas9を組込んだRCas9により、ストレス顆粒への移行などmRNAの細胞内動態の可視化を実現した(CRISPR関連文献メモ_2016/03/19RCas9によるRNA追跡))。
  • 今回、Gene W. YeoUCSDとフロリダ大学の研究チームは、RCas9によりマクロサテライト反復伸長(Microsatellite repeat expansions, MREs)由来RNAsを標的・編集し、MREs由来の反復RNAやタンパク質に由来する疾患の診断と治療へとRCas9を展開可能なことを示した。

[] MREs疾患と対応する反復配列の例

MREsの可視化

  • RCas9(dCas9:sgRNA-GFP)によりCTG 105コピー、CCTG 300コピーまたはCAG 80コピーをコードしたプラスミドを導入したCOS-M6細胞に形成されるRNA fociの蛍光像が、RNA FISHによるRNA fociの蛍光像と一致することを確認(ただし、適切なsgRNAの選択が必要)。この際、PAMmerの存在の如何によらずRNA FISHRCas9からのシグナルが十分一致することを見出した。すなわち、PAMmerは反復配列RNAの認識には必須ではないことが明らかになった。

RCas9によるRNA fociの除去

  • COS-M6細胞において、dCas9-GFPとテロメラーゼ結合タンパク質EST1A遺伝子SMG6由来のPIN RNAエンドヌクレアーゼ・ドメインを融合しHAで標識したPIN-dCas9のいずれもが、CUGexp, CCUGexp, GGGGCCexpおよびCAGexp由来のRNA fociを除去することを確認。
  • このRCas9活性にはPAMmer依存性が見られず、また、CUGリピートを対象とする詳細実験からPIN-dCas9dCas9-GFPよりも低濃度でMREsを除去可能なことから、以後の実験はPIN-dCas9にてPAMmer無しで行った。
  • また、RCas9CUG反復配列に直接結合することを同定し、RNA結合タンパク質のCUG反復配列への結合不安定化の機構の存在が示唆された。
  • RNAを標的とする療法では、転写される病原RNAを継続的に対処する必要があることから、比較的長期間外来遺伝子を生成可能なAAVによるRCas9システム送達が望ましい。そこで、 それぞれ長さが4.33.9 kbPIN-dCas9(ΔHNH) and PIN-dCas9(ΔHNH,ΔREC2) も作出した。

患者由来細胞におけるRNA foci除去

  • DM1DM2の患者由来の細胞において、PIN-dCas9CUGexpまたはCCUGexpを標的とするsgRNAによって、ほとんど完全にRNA fociを除去可能なことを確認した。

RCas9DM1に見られるスプライシング異常を修復

  • CUGexpが存在するDM1では、スプライシング因子MBNL1RNA fociへの凝集を介して、筋において選択的スプラシング異常が起こっている。
  • COS-M6細胞に、GPFで標識したMBNL1PIN-dCas9およびCUGexpを標的とするsgRNAまたは標的としないsgRNAをコードするプラスミドを送達し、RNA FISHCUGexpを可視化し、RCas9システムによってMBNL1RNA fociから遊離することを見出した。また、DM1患者由来筋芽細胞でも、抗-MBNL1抗体を利用した免疫蛍光法でCOS-M6細胞で見られたと同様のMBNL1の再配置を観察した。
  • RNA-seqによるゲノムワイドでの解析から、RCas9がスプライシング異常をゲノムワイドで修復することも確認

RCas9は、ポリグルタミンタンパク質レベルを低減する

  • CAGexpRNAsを標的とするRCas9によって、ハンチントン病などの原因タンパク質であるpolyQを低減