[出典] “CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription systems to
induce neuronal differentiation.” Nihongaki Y, Furuhata Y, Otabe T, Hasegawa S,
Yoshimoto K, Sato M. Nat Methods. 2017 Sep 11.
- 研究チームは2015年に、dCas9と転写活性化因子及びシロイヌナズナ由来光スイッチシステム(CIB1とCYR2の結合・遊離)を組合せたCRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system (CPTS)、続いて、菌類由来光スイッチシステムMagnetを組込んだpaCas9/padCas9、さらにCre-loxPシステムとの融合と、光遺伝学ツールボックスを拡張してきた。
- 今回、padCas9と、他グループによって開発された転写活性化技法三種類との融合を評価し、その結果に基づいてF. Zhangらが開発したCas9 SAM (Synergistic Activation Mediators)の技法を融合、最適化を経て、CPTSとCas9 SAMよりも強力な転写活性化をもたらすSplit-CPTS2.0とCPTS2.0を確立した:Split-CPTS2.0(dCas9(2-713)+pMag;dCas9(714-1368)+nMagHigh1/ VP64;MS2アプタタマーを組込んだsgRNAとMS2+p65+HSF1); CPTS2.0(dCas9; MS2アプタマーを組込んだsgRNAとCIB1およびCRY2+p65+HSF1)
- Split-CPTS2.0の性能:HEK293T、HeLaおよびヒト初代繊維芽細胞でASCL1を強力に上方制御;MYOD1, IL1R2およびHBG1の同時上方制御;光照射を12時間で停止すると、停止後ASCL1の発現が徐々に低減するが36時間後も発現継続;
- CPTS2.0の性能:HEK293T、HeLaおよびヒトiPSCsにおいてCPTSよりも強力に転写活性化;光照射を12時間で停止後、Split-CPTS2.0と異なり、転写活性は急激に低減し24時間でコントロールと同レベルに
- NEUROD1転写活性化によるiPSCsの神経細胞への分化: CPTS、CPTS2.0およびSplit-CPTS2.0は1時間の光照射後にそれぞれコントロールに対して29倍、436倍、25,000倍の活性化効果を示したが、Split-CPTS2.0のみが神経細胞分化を達成。
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