1.SunTag法をポリシストロニックへと拡張することで、テロメアの超解像顕微鏡による分析を実現
  • [出典]"(Po)STAC (Polycistronic SunTAg modified CRISPR) enables live-cell and fixed-cell super-resolution imaging of multiple genes" Neguembor MV,  Sebastian-Perez R,  Aulicino F, Gomez-Garcia PA, Cosma MP, Lakadamyali M. Nucleic Acids Res. 2017 Dec 23.
  • 蛍光タンパク質(FP)をdCas9に融合するCRISPR技術によって、生細胞内で反復配列および非反復配列の多重可視化(多色化)が進展した。しかし、FPによる標識効率が低く、超解像顕微鏡法への展開は進まなかった。Barcelona Institute of Science and Technologyの研究チームは今回、SunTagとポリシストロニクス・ベクターの既存の2つの技術を組み合わせることで、超解像顕微鏡によるテロメア動態の観察を実現した。
  • SunTag法によって標的を24コピーまでの蛍光タンパク質sfGFPで標識し(下図左のA;ただし、Protein Cell論文からの引用)、ポロシストロニクス・ベクター(下図Supplementary Figure 1(B))によって、内在リボヌクレアーゼの標的となるtRNAとsgRNAのペアを反復させた合成遺伝子からsgRNAsを精密かつ多重に発現することで、標識効率と標識からのシグナル強度を改善し、PoSTAC (Polycistronic SunTAg-modified CRISPR) と称し、ポリシストロニック・ベクターを使用しない手法をSTAC (SunTAg modified CRISPR)と称した。
(Po)STAC 1 (Po)STAC 2 
  • (Po)STACによる、標識効率と蛍光シグナルのS-N比(標的に結合したdCas9-FPからの蛍光と、核質内に滞留す非結合dCas9-FPからの蛍光の比)の改善:HeLa細胞において、配列の反復度が高いテロメアと、配列の反復度が中程度あるいは低いMucin1 と4(MUC1とMUC4)を標的とする(Po)STACの効果を共焦点顕微鏡で確認(上図右 Figure 1 -A-E)
  • テロメアの長さが短い(6 kb)のHeLaと長い(23 kb)のHeLa1.3の固定細胞において、STACと超解像顕微鏡STORM(STochastic Optical Reconstruction Microscopy) でテロメア・コンパクションを可視化比較(上図右;Figure 2-Dは、ボロノイテッセレーションによるテロメア領域の同定と比較)
(Po)STAC 2 (Po)STAC 3
  • STAC-STORMにより、HeLaとHeLa1.3の生細胞内でのテロメア動態観察(上図右)
2.[プロトコル(ビデオとPDF)]標的DNAの酵素消化により、任意のDNA源から大規模gRNAライブラリーを、効率的かつ低コスト構築可能とするシンプルなプロトコル
  • [出典]"A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source" Köferle A, Stricker SH. J Vis Exp. 2017 Dec 6;(130). ビデオPDF
  • オリゴヌクレオチド合成に替わる大規模で複雑なgRANライブラリーを構築する手法"CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity)"のプロトコル
3.[研究資源]CRISPR/Cas9によりヒトES細胞からFHL2ホモ型ノックアウト細胞株を樹立
4.イネにおいて、野生型SpCas9は、NGG PAMと共にNAG PAMも認識し、安定したゲノム編集を実現する
[出典]"Robust genome editing of CRISPR-Cas9 at NAG PAMs in rice" Meng X, Hu X, Liu Q, Song X, Gao C, Li J, Wang K. Sci China Life Sci. 2017 Dec 25.