(構造生命科学ニュースウオッチ2016/03/23から転載)

  • [出典]平野清一(Seiichi Hirano), 西増弘志, 石谷龍一郎 & 濡木 理. "Structural Basis for the Altered PAM Specificities of Engineered CRISPR/Cas9." Mol. Cell. 2016 Mar 17;61(6):886-94.
  • Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)変異型[注]が認識するPAM配列 
    [注] B. J. Kleinstiver(J. Keith Joung研究室)ら、Nature オンライン2015年6月22日
    • WT:5’-NGG-3’
    • VQR (D1135V/R1335Q/T1337R)変異体:5’-NGA-3’
    • EQR (D1135E/R1335Q/T1337R)変異体:5’-NGAG-3’
    • VRER (D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)変異体:5’-NGCG-3’
    • Arg1335単独の変異(R1335QとR1335E):PAM認識とヌクレアーゼ活性不全 
      [注] R1333とR1335はPI(PAM-interacting)ドメイン(挿入図「Cas9によるDNAの切断機構」参照)に位置している.36030001
  • 研究チームは今回、PAM拡張に至った3種類の変異体それぞれについて、sgRNAならびに改変PAMを含む標的DNAの部分的二本鎖が結合した状態の結晶構造を高分解能で解き(*)、野生型Cas9との構造比較から、多重変異の導入によってホスホジエステル骨格のコンフォメーションが変化するところから、Cas9変異体がCas9野生型のPAMと異なるPAMを認識可能になることを明らかにした。
  • (*) PDB登録構造

5B2R: Crystal structure of the Streptococcus pyogenes Cas9 VQR variant in complex with sgRNA and target DNA (TGA PAM)(分解能 2 Å)

5B2S: Crystal structure of the Streptococcus pyogenes Cas9 EQR variant in complex with sgRNA and target DNA (TGAG PAM)(分解能 2.2 Å)

5B2T: Crystal structure of the Streptococcus pyogenes Cas9 VRER variant in complex with sgRNA and target DNA (TGCG PAM)(分解能 2.2 Å)
36030002 36030003 36030004

  • [PAMとCas9の結合:以下でHBは水素結合、b-HBはbidentate型水素結合を意味する]
    • 5’-NGG-3’とWT:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dG3*〜Arg1335 (b-HB)
    • 5’-NGA-3’とVQR:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dA3*〜Gln1335 (b-HB);[dG4*〜Arg1337 (b-HB)オプション]
    • 5’-NGAG-3’とEQR:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dA3*〜Gln1335 (b-HB) & dG4*〜Arg1337 (b-HB)
    • 5’-NGCG-3’とVPER:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dC3*とGlu1335 (HB) & dG4*〜Arg1337 (b-HB) & dC3*とdG4*の間のDNA骨格のリン酸塩〜Arg1218(G1218R)(静電的相互作用);[dC3*〜Glu1335 (HB)の弱い結合を他の相互作用が相補]
  • [Cas9変異体が改変PAMを認識する機構] 多重変異が協働してPAM二重鎖のホスホジエステル骨格を変位させ、Arg1335から変異したGln1335またはGlu1335による改変PAM3番目のヌクレオチドの認識を可能とする.今回明らかになったCas9変異体が改変PAMを認識する機構は、Staphylococcus aureus Cas9のKKH変異体やSpCas9のVRQR変異体の改変PAM認識や活性の変化にも共通する機構である.
  • [関連文献]