(構造生命科学ニュースウオッチ2016/03/23から転載)
- [出典]平野清一(Seiichi Hirano), 西増弘志, 石谷龍一郎 & 濡木 理. "Structural Basis for the Altered PAM Specificities of Engineered CRISPR/Cas9." Mol. Cell. 2016 Mar 17;61(6):886-94.
- Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)変異型[注]が認識するPAM配列
[注] B. J. Kleinstiver(J. Keith Joung研究室)ら、Nature オンライン2015年6月22日 - 研究チームは今回、PAM拡張に至った3種類の変異体それぞれについて、sgRNAならびに改変PAMを含む標的DNAの部分的二本鎖が結合した状態の結晶構造を高分解能で解き(*)、野生型Cas9との構造比較から、多重変異の導入によってホスホジエステル骨格のコンフォメーションが変化するところから、Cas9変異体がCas9野生型のPAMと異なるPAMを認識可能になることを明らかにした。
- (*) PDB登録構造
5B2R: Crystal structure of the Streptococcus
pyogenes Cas9 VQR variant in complex with sgRNA and target DNA (TGA
PAM)(分解能 2 Å)
5B2S: Crystal structure of the Streptococcus
pyogenes Cas9 EQR variant in complex with sgRNA and target DNA (TGAG
PAM)(分解能 2.2 Å)
5B2T: Crystal structure of the Streptococcus
pyogenes Cas9 VRER variant in complex with sgRNA and target DNA (TGCG PAM)(分解能 2.2
Å)
- [PAMとCas9の結合:以下でHBは水素結合、b-HBはbidentate型水素結合を意味する]
- 5’-NGG-3’とWT:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dG3*〜Arg1335 (b-HB)
- 5’-NGA-3’とVQR:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dA3*〜Gln1335 (b-HB);[dG4*〜Arg1337 (b-HB)オプション]
- 5’-NGAG-3’とEQR:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dA3*〜Gln1335 (b-HB) & dG4*〜Arg1337 (b-HB)
- 5’-NGCG-3’とVPER:dG2*〜Arg1333 (b-HB) & dC3*とGlu1335 (HB) & dG4*〜Arg1337 (b-HB) & dC3*とdG4*の間のDNA骨格のリン酸塩〜Arg1218(G1218R)(静電的相互作用);[dC3*〜Glu1335 (HB)の弱い結合を他の相互作用が相補]
- [Cas9変異体が改変PAMを認識する機構] 多重変異が協働してPAM二重鎖のホスホジエステル骨格を変位させ、Arg1335から変異したGln1335またはGlu1335による改変PAM3番目のヌクレオチドの認識を可能とする.今回明らかになったCas9変異体が改変PAMを認識する機構は、Staphylococcus aureus Cas9のKKH変異体やSpCas9のVRQR変異体の改変PAM認識や活性の変化にも共通する機構である.
- [関連文献]
- Cell Report 同号掲載プレビュー Virginijus Siksnys & Giedrius Gasiunas. "Rewiring Cas9 to Target New PAM Sequences." Mol. Cell. 2016 Mar 17;61(6):793-4. http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.03.002
- Cell Report 同号掲載同テーマ短報 Carolin Anders, Katja Bargsten & Martin Jinek. "Structural Plasticity of PAM Recognition by Engineered Variants of the RNA-Guided Endonuclease Cas9." Mol. Cell. 2016 Mar 17;61(6):895-902.
- 濡木研究室のFrancisella novicida Cas9変異体とPAMの改変論文(CRISP_BIO 2017/08/27参照) 平野央人(HIRANO Hisato) et al. "Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9" Cell. 2016 Feb 25;164(5):950-61. Published online 2016 Feb 11.
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