1.人工マウス染色体(MAC)ベクターにCRISPR/Cas9による薬剤選択マーカ・ノックアウトを組み合わせることで、5種類までの複数遺伝子を帯びたMACベクターの標的細胞への導入を実現
  • [出典]"Development of a multiple-gene-loading method by combining multi-integration system-equipped mouse artificial chromosome vector and CRISPR-Cas9" Honma K, Abe S, Endo T, Uno N, Oshimura M, Ohbayashi T, Kazuki Y. PLoS One. 2018 Mar 5;13(3):e0193642.
  • 鳥取大学の香月康宏らは先行研究にて、ヒト人工染色体 (HAC:human artificial chromosome)よりも安定性を高めたマウス人工染色体 (MAC:mouse artificial chromosome)、続いて、MACに5サイトでの部位特異的組換え (SSR:site-specific recombination)により遺伝子ローディングベクター (GLVs:gene-loading vectors)の多重化を実現した多重インテグラーゼ (MI)システムを組み込んだMI-MACを開発してきた。
  • このMI-MACは理論上5種類のGLVsを保持可能であるが、実用上は、多重GLVsの連続導入に必要な選択マーカに利用可能な薬剤数からの限界があった。研究チームは今回、CRISPR-Cas9技術を利用することで、マーカのノックアウト・再利用を可能とし、この限界を突破した。
  • 5ヶ所のSSRサイトに5種類のGLVs(5種類の蛍光タンパク質に対応)を帯びたMI-MACベクターをチャイニーズハムスター卵巣由来CHO K1細胞に導入し、このMI-MACをヒト軟部腫瘍由来HT1080細胞に微小核細胞融合法 (MMCT:microcell-mediated chromosome transfer)で移植し、5種類の蛍光タンパク質発現を確認(下図左 - MI-MACベクター構築/MMCTによるワークフロー;下図右 - GLVのインテグレーションと同時に薬剤耐性遺伝子ノックアウト)
MI-MAC CRISPR-Cas9 -1 MI-MAC CRISPR-Cas9 -2
2.哺乳類細胞におけるCpf1によるゲノム編集を効率化するCRISPR RNAs (cRNAs)の化学修飾
  • [出典]"Chemically modified Cpf1-CRISPR RNAs mediate efficient genome editing in mammalian cells" McMahon NA, Prakash TP, Cleveland DW, C. Bennett CF, Rahdar M. Mol Ther 2018 Mar6.
  • Cpf1-crRNA の結晶構造を参照しつつcrRNAsの短縮と化学修飾の効果を体系的に解析
3.バクテリオファージは協働してバクテリアのCRISPR-Cas3とCas9による免疫応答を抑制する
  • [出典]“Bacteriophage cooperation suppresses CRISPR-Cas3 and Cas9 immunity” Borges AL, ~ Bondy-Denomy J. bioRxiv. Posted March 8, 2018
  • ファージのanti-CRISPR (Acr)タンパク質がバクテリアの免疫応答を回避する機構;複製できなかったファージのゲノム由来Arcが宿主細胞の免疫を抑制することで、他のファージの免疫回避を実現する;ウイルス濃度が低いと、宿主細胞へのウイルス再感染が起こりにくく、宿主細胞生存;ウイルス濃度が高いと、免疫が抑制された細胞への再感染の確率が高まる(下図参照)
Phage cooperation to suppress CRISPR-Cas immunity
4.ヒトリンパ腫由来細胞株U937細胞においてASXL1変異が骨髄細胞分化不全を誘起する
  • [出典]"CRISPR/Cas9-mediated ASXL1 mutations in U937 cells disrupt myeloid differentiation" Wu XJ, ~ Young NS. Int J Oncol. 2018 Feb 28.
  • よく知られた腫瘍抑制遺伝子でありエピゲノム修飾因子であるASXL1は、骨髄性悪性腫瘍において高頻度で変異している。米国NHLBIの研究チームは今回、ASXL1変異による癌化の分子機構解明を目指してCRISPR/Cas9によるASXL1へテロ接合型/ホモ型変異を導入し、細胞増殖と細胞周期進行について、野生型と比較解析を行った。
5.Tropomyosin 2 (Tpm2) が、水晶体の創傷治癒と老化に決定的役割を果たす
  • [出典]"Tropomyosin 2 heterozygous knockout in mice using CRISPR-Cas9 system displays the inhibition of injury-induced epithelial-mesenchymal transition, and lens opacity" Shibata T, ~ Kubo E. Mech Ageing Dev. 2018 Mar 3.
  • 白内障手術後の水晶体上皮細胞における上皮間葉転換 (EMT)の過程が、組織の繊維化、創傷治癒および水晶体再生をもたらす分子機構解明を目指して;CRISPR/Cas9により作出したTpm2ヘテロ接合型ノックアウト・マウスにおいて、傷害に応答する上皮間葉転換 (EMT)が阻害され、水晶体が混濁
6.[Letter to the Editor]CRISPRスクリーンからCDK7を肝細胞癌の治療標的と同定
  • [出典]"A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma" Wang C, ~ Qin W, Bernards R. 
7.Cas9ニッカーゼ (Cas9n)によるゲノム編集によって、ラットにおいて遺伝性チロシン血症 (HTI:Hereditary tyrosinemia type I)変異を修復
  • [出典]"Cas9-nickase-mediated genome editing corrects hereditary tyrosinemia in rats" Shao Y, ~ Li D. J Biol Chem. 2018 Mar 5.
  • HTIモデルラットにおいて、HTI病因のフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ (FAH:fumarylacetoacetate hydrolase)変異修復;Cas9n編集は、Cas9編集で見られるオンターゲットindelを誘発することなく、また、表現型も改善
8.CRISPR-Cas9 RNPsによりゼブラフィッシュ遺伝子のドメイン特異的変異導入と表現型解析
  • [出典]"Analysis of novel domain-specific mutations in the zebrafish ndr2/cyclops gene induced by CRISPR-Cas9 RNPs" Turner AN, ~ Challa AK. bioRxiv. Posted March 6, 2018
  • 下図:左 - ndr2遺伝子の構造とCRISPR編集標的;右 - ndr2タンパク質の構造
zebrafish ndr2-cyclops -1 zebrafish ndr2-cyclops -2
9.CRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウト/ノックイン全エクソームシーケンシングにより、78人のコホートから同定したヒト男性不妊関連常染色体上遺伝子ホモ接合型変異に対応するモデルマウスを作出
  • [出典]"Creation of knock out and knock in mice by CRISPR/Cas9 to validate candidate genes for human male infertility, interest, difficulties and feasibility" Kherraf ZF, ~ Ray PF. Mol Cell Endocrinol. 2018 Mar 6.
10.CRISPR/Cas9によるDNAウイルスのゲノム編集には、1 sgRNAに変えて2 sgRNAsを利用すべき
  • [出典]"CRISPR/Cas9-mediated 2-sgRNA cleavage facilitates pseudorabies virus editing" Tang YD, ~ An TQ, Cai XH. FASEB J. 2018 Mar 6.
  • 仮性狂犬病ウイルス (PRV:pseudorabies virus)をモデルとして実証; アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来Vero細胞に、PRVと2 sgRNAsのCRISPRシステムとを同時に形質導入することで、ウイルスの非必須セグメント大領域(3,500 bp以下)を100%の効率でノックアウトし、ノックインも86%までの効率で実現