1.フレームシフト変異に起因するジストロフィン欠損マウスの機能をCampylobacter jejuni Cas9で回復
  • "Functional rescue of dystrophin deficiency in mice caused by frameshift mutations using Campylobacter jejuni Cas9" Koo T, ~ Kim JS. Mol Ther. Available online 30 March 2018.
  • デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD)の51%に、複数エクソン欠損に由来するフレームシフトが起きている。Jin-Soo Kimら韓・英の研究チームは今回、モデルマウスにおいてCjCas9によってDmdフレームシフト変異を修復可能なことを示した。
  • SpCas9により、フレームシフト変異を伴うDmdノックアウトマウスを作出し、続いて、Dmd KOマウスの前脛骨筋において、オールインワンAAVベクターを利用して、CjCas9、sgRNAおよびeGFP遺伝子を発現させた。
  • CjCas9はDmd遺伝子の標的サイトをin vivoで効率的に切断し、標的サイトに小規模な挿入または欠損を生成し、読み枠が壊れていたDmd遺伝子をアウトオブフレームからインフレームへと修復し、モデルマウスの筋力も回復した。オフターゲット編集は見られなかった。
2.Cpf1により脊髄性筋萎縮症の原因変異遺伝子を変換
  • "Seamless genetic conversion of SMN2 to SMN1 via CRISPR/Cpf1 and single-stranded oligodeoxynucleotides in spinal muscular atrophy patient-specific iPSCs" Zhou M et al. Hum Gene Ther. 2018 Mar 29
  • 脊髄性筋萎縮症(spinal muscular atrophy : SMA)は、脊髄において運動神経が徐々に失われていく神経筋疾患であり、運動神経細胞生存(survival motor neuron)遺伝子1 (SMN1)の変異が病因である。SMN1にはその近傍にパラログSMN2が存在する。SMA患者由来のiPSCsの確立とその遺伝子変異修復は、SMAの有力な治療戦略である。
  • 中南大学の研究チームは今回、SMA-iPSCsを作出し、CRISPR/Cpf1、crRNAおよびssODNによるHDRを介して、SMN2遺伝子をSMN1様遺伝子へと変換した。
  • 遺伝子変換iPSCと運動ニューロンはSMN発現がレスキューされた。遺伝子変換の効率は11%であり、得られたクローンには外来遺伝子が含まれずまた核型は正常であった。
3.Cpf1による遺伝子編集の効率を向上する低分子を同定
  • "Small molecules promote CRISPR-Cpf1-mediated genome editing in human pluripotent stem cells" Ma X, ~ Zhu S (浙江大学). Nat Commun. Published online 03 April 2018.
  • CRISPR-Cpf1によるノックアウト:293T細胞とhESCsならびにhiPSCsにて、indel生成効率20-30%を実現
  • CRISPR-Cpf1によるノックイン (ピューロマイシン選択):Cpf1、OCT4を標的とするcrRNA、ならびにドナー(eGFPレポーターとピューロマイシン耐性カセット)、の3種類のプラスミドをそれぞれエレクトロポレーション;~600種類の低分子のライブラリーからノックイン効率を向上させる低分子をスクリーンし (下図 Fig.2-a)、最も効果的な低分子2種類 (VE-822とAZD-7762; 下図 Fig.2-c)を同定
CRISPR-Cpf1
  • CRISPR-Cpf1によるノックイン (ピューロマイシン選択無し):ドナーとしてOCT4-2A-tdTomatoを使用;VE-822とAZD-7762によりノックイン効率向上し、また、2つの低分子の効果は相加的;ssODNをドナーとする点変異導入効率も向上
4.AAV6によるCRISPR-Cas9システム送達によるマウス胚遺伝子編集
  • "[Tools in Brief] Genomics: Genome editing with ease" Nature Methods 03 April 2018.
  • 組換えAAV (AAV6)によって、CRISPR- Cas9システムを着床前胚や妊娠雌性マウスの卵管へ送達することで、マウス胚のex vivo/in vivoゲノム編集を効率化した手法(*)を紹介
  • (*) [crisp_bio紹介記事] CRISPRメモ_2018/02/02-3 - 9.組換えAAV(rAAVs)を利用して、マウス胚のex vivo/in vivoゲノム編集を効率化;[論文] "Streamlined Ex Vivo and in Vivo Genome Editing in Mouse Embryos Using Recombinant Adeno-Associated Viruses" Yoon Y, Wang D, Tai PWL, Riley J, Gao G, Rivera-Pérez JA. Nat Commun. 2018 Jan 29;9(1):412.;
5.エレクトロポレーションによるラット胚遺伝子編集
  • "Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method" Kobayashi T, Namba M, Koyano T, Fukushima M, Sato M, Ohtsuka M, Matsuyama M. BMC Biotechnology (2018) 18:19
  • CRISPR/Cas9による遺伝子改変マウス作出を効率化したi-GONAD(improved Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery: I-GONAD)法(*)をラットに展開したrGONADを開発
  • (*) CRISPRメモ_2018/03/04 - 1. i-GONAD:CRISPRヌクレアーゼによる安定したin situ生殖細胞ゲノム編集法
6. CRISPRによる聴力回復
  • "A CRISPR Way to Restore Hearing" Chien WW. N Engl J Med 2018; 378:1255-1256
  • 難聴マウス遺伝子治療論文(*)をハイライト
  • (*) [crisp_bio記事] CRISPRメモ_2017/12/22- 1 Cas9-sgRNA RNPをカチオン性脂質でベートーベン・マウスに直接送達することで、常染色体優性難聴の遺伝子治療が可能性なことを示した;[論文] "Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents" Gao X, ~ Chen ZY, Liu DR. Nature. 2017 Dec 20. 2017.;
7.[レビュー]CRISPR/Cas9: 暗黒帝国(疾患)に抗するジェダイ
  • "CRISPR/Cas9: the Jedi against the dark empire of diseases" Khan S, Mahmood MS, Rahman SU, Zafar H, Habibullah S, Khan Z, Ahmad A (Department of Biochemistry/U.S.-Pakistan Center for Advanced Studies in Agriculture and Food Security). J Biomed Sci. 2018 Mar 28;25(1):29
  • CRISPR/Casの基本と研究資源一覧(キット; プラスミド; sgRNA設計ツール);各種疾患のモデル作出と療法(癌;遺伝病;ウイルス疾患;神経疾患;アレルギーと免疫疾患;病原微生物);遺伝子ドライブ