出典
  • "Leveraging genetic variants for personalized and allele-specific sgRNA design" Keough KC, Lyalina S, Olvera MP, Whalen S, Conklin BR, Pollard KS. bioRxiv 2018 June 8.
概要
  • ExcisionFinderで設計したsgRNAsは、個人ゲノムや集団に特有な遺伝子のホモ型変異とヘテロ型変異の編集を可能とする。ExcisionFinderで設計したsgRNSsを利用することで、培養細胞および動物モデルにおいて、ハンチントン病や網膜色素変性症を含むドミナントネガティブ遺伝子の病因変異アレルを特異的に修復することが可能である。
11種類のCasヌクレアーゼが標的可能なアレル特異的変異 (下図左(原論文Fig. 1) 参照)
  • 11種類のCasヌクレアーゼの少なくとも一種類が、1000人ゲノムプロジェクト (1KGP ; 2,504人のゲノムデータ) データベースに登録されたヘテロ型変異を標的可能
  • A) PAMまたはPAM以外の領域におけるヘテロ型変異(黄色のバー)のモデル
  • B) 1KGPでアノテーションされた~8,100万変異の中で、11種類のCasヌクレアーゼで標的可能なヘテロ型変異のほとんどがPAM内まはたPAM近傍に位置。したがって、いわゆる参照ゲノム(ヒトゲノムGRCh38  ;マウスゲノム GRCm38)から設計したsgRNAが無効になる一方で、アレル特異的sgRNAの設計が可能になり、また、病因変異修復に利用可能。
  • C) 1KGPコホートにおいて11種類のCasヌクレアーゼと最大10-kilobases (kb)の間隔の1対のアレル特異的sgRNAsにより標的可能なタンパク質コーディング遺伝子の割合。平均77%であるが、非コーディング領域におけるアレル特異的sgRNAも採用することで標的可能な遺伝子を広げることが可能 (コーディング領域に隣接する5 kbへと範囲を広げることで標的可能遺伝子の割合が85%へ増加)
Leveraging genetic variants 1 Leveraging genetic variants 2
網膜色素変性症の原因遺伝子RHOを標的とするアレル特異的sgRNAsペアの同定 (上図右 (原論文 Fig. 2) 参照)
  • A) 1KGPコホートの>10%に、RHOコーディング領域およびその両側1-kbの領域に82組のsgRNAsペアを同定
  • B) 標的可能な遺伝子を帯びた個人の割合は、人類集団間で異なるが、1KGPコホート全体の57%をアレル特異的sgRNAsペアで標的可能;ExcisionFinderのアルゴリズムには、できる限り少数のアレル特異的sgRNAsペアで、特定の人類集団内の最も多数の個人に有効なsgRNA設計を組込。
  • C) ヒトiPSCモデル細胞WTCにおいてヘテロなrs3733148変異に対するSpCas9-sgRNA:アレル特異的sgRNAと個人特異的sgRNA。
  • D) CRISPORで判定した特異性:参照ゲノムに基づくsgRNAsとアレル特異的sgRNAs比較
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