カテゴリ: CRISPR

[出典] The promise and challenge of therapeutic genome editing. Doudna, JA. Nature 2020-02-12

 CRISPRゲノム編集技術は5-10年のうちに、いくつかのヒト疾患について、クリニックによる治療に適用されるようになることが見えている。この驀進し続けるCRISPR医療技術についていまこそ、学術研究、臨床および生命倫理と、医療経済ならびに規制に関わるコミュニティーとが協働して、CRISPRゲノム編集技術による安全で効果的な医療を誰でもが受けられるような社会への道筋をつけておく時である。

単一遺伝子疾患の事例 - 鎌状赤血球症 (SCD)とデュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD)
  • Fig. 1: Ex vivo and in vivo genome editing to treat human disease.
  • SCD: βグロビン (HBBex vivo 造血幹細胞においてA-to-T (Glu-to-Val): CRISPR-Cas9 HDRによる野生型遺伝子への修復や胎児型γグロビンの発現誘導; ex vivo
  • DMD: ジストロフィン遺伝子 in vivoエクソン51の読み飛ばしなど; in vivo
ゲノム編集戦略の拡がり
組織特異的デリバリーの実現
  • Table 1 Methods for delivering genome-editing tools
  • ナノ粒子、ウイルスおよびRNPsによるデリバーについて、特徴、サイズ、デリバリー対象、長所、短所および標的組織の一覧
ゲノム編集のaccuracy, precisionおよび安全性の課題は解決可能
  • Accuracy (オンターゲット編集とオフターゲット編集の比とprecision (オンターゲット編集結果に、意図した編集結果が占める比)の双方を精密に判定する必要があり、米国NISTは、その標準化に向けて、Genome Editing Consortiumを設置
  • 編集結果の予測を困難にする二本鎖DNA切断 (DSB)を回避する手法 (dCas9と転写制御因子またはエピゲノム制御因子の融合;デアミナーゼの融合によるbase editing)についても、accuracy, precisionおよび安全性の評価が必須
  • ゲノム編集システムの免疫原性の精査
ゲノム編集医療のコスト
  • 体細胞ゲノム編集技術によるCAR-T細胞療法、SCDなどの血液疾患治療、眼疾患の治療の治験が進行中、DMD治療の治験が始まる。
  • CRISPR技術は誰でもが使える技術になったが、ゲノム編集医療は極めて高額になる。SCDの場合は、標的変異が共通であるが、それでも一人あたり~100,000 USドルの治療を数百万人に行うことになる。多様な病因変異が存在するDMDの場合は、個々に病因変異を同定した上で、最適なCRISPRシステムを設計・利用することになり、また、早期診断が予後に直結するため、SCDよりも複雑な治療となり、かつ、一人あたりの経費もより高額な治療となる。
  • ゲノム編集医療の発展のためには、ガイドラインと経費分担の新たな枠組みが必要である。
ヒト生殖細胞系列のゲノム編集
  • Fig. 4: Editing the human germline
  • ヒトの発生機構を理解するためには、ヒト胚ゲノム編集は有用である: ヒト胚におけるCRISPR-Cas9ゲノム編集がもたらす結果についての報告は、未だ、混沌とした状態であり (例えば、DSBの修復が外来ドナーDNAテンプレートによるのか、遺伝子座の他のアレルをテンプレートとするのか)、また、発生初期においてマウスとヒトの間で一連の遺伝子の作用が異なることが明らかになってきた (crisp_bio 2017-09-22)。
  • CRISPRbabies以後、続いている 将来のヒト胚ゲノム編集による遺伝疾患治療の前提条件の設定に至るまでの議論

1. E. coliのタイプI-E CRISPR-Casシステムにおけるプライム型 [*]スペーサ獲得の分子機序の詳細明らかに
[出典] Characterization of Primed Adaptation in the Escherichia coli type I-E CRISPR-Cas System. Stringer AM [..] Wade JT. bioRxiv 2020-02-12
  • Wadsworth Center (ニューヨーク州)の研究グループが、Cas3を含む複合体が、ゲノムDNA上をCascadeの結合サイトから長い距離 (> 100 kb)を移動し、その間、全てのAAGまたはその近傍で切断し、Cas1-2がCRISPRアレイにスペーサとして取り込む断片が生成されるとした。
  • [*] Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system. Datsenko KA, Pougach K, Tikhonov A, Wanner BL, Severinov K, Semenova E. Nat Commun 2012-07-10. (Figure 5から、プラム型とナイーブ型のスペーサ獲得の模式図を下図に引用、それぞれ、a と c を参照)203af935
  • [関連記事] crisp_bio 2019-10-11 タイプ I-E/F CRISPR Casシステムのプライム型アダプテーション過程で生成されるスペーサー前駆体を検出
2. DNA依存性プロテインキナーゼ (DNA-PK)を一時的に阻害することで、CRISPR-Cas9による遺伝子削除を亢進
[出典] Enhancing CRISPR deletion via pharmacological delay of DNA-PK. Bosch N [..] Johnson R. bioRxiv 2020-02-13
  • University of Bernの研究グループは、NHEJ過程の初期段階で一時的にDNA-PKを阻害して、DNA-PKの作用を遅らせることで、CRISPR-Cas9 KOを17倍まで亢進した。
  • この効果は、標的細胞株、遺伝子デリバリー法、阻害剤およびgRNAsの影響を受けず、gRNAのレンチウイルスライブラリを利用するプール型機能スクリーニングにも展開可能である。
3. 失敗に終わることが多いCRISPR/Cas9ノックアウト実験の改善法
[出典] An improved strategy for CRISPR/Cas9 gene knockout and subsequent wildtype and mutant gene rescue. Jin J [..] Song S, Ajani JA. PLoS One 2020-02-13. 
  • University of Texas MD Anderson Cancer Centerの研究グループが、レンチウイルスベクター (すなわち、CRISPR/Cas9プラスミド)に蛍光マーカmOrange (可視化)とピューロマイシン耐性遺伝子 (簡便なセレクション)を組み込むことで、安定した標的遺伝子ノックアウト細胞を効率よく選別する手法を開発し、胃癌細胞株のAGSとGT5において、RhoA, Gli1, およびGalのノックアウト細胞株を樹立し、続いて、野生型遺伝子と変異遺伝子のレスキュー実験も実現した。
4. CRISPR/Cas9 HITI法 [*]によるノックイン技術を介して生細胞のマルチモーダルな可視化を実現
[出典] A Safe Harbor-Targeted CRISPR/Cas9 Homology Independent Targeted Integration (HITI) System for Multi-Modality Reporter Gene-Based Cell Tracking. Kelly JJ [..] Ronald JA. bioRxiv 2020-02-12.
  • University of Western Ontarioの研究グループが、 CRISPR/Cas9 HITI MC (ミニサークル) システムを介してセーフハーバに、蛍光分子、生物発光分子およびMRI造影レポーター遺伝子 (Oatp1a1)を組み込むことで、標題を実現した。
  •  [*] crisp_bio 2019-08-30 HITI法からSATI法へ進化 - 早老症モデルマウスの点変異修復
5. Heidelberg CRISPR Fly Design Library’ (HD_CFD library)
[出典] "A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila" Port F [..]  Boutros M. eLife 2020-02-12
  • CRISPR/Cas9により組織特異的変異を誘導したショウジョウバエ1,700変異系統のライブラリを構築
  • 2019-05-13のbioRxiv投稿時 [*]の1,264遺伝子を標的とするsgRNAsペアを帯びた1,428系統の規模から、eLife論文では1,700系統の規模へと拡大; Vienna Drosophila Resource Cente (https://stockcenter.vdrc.at/control/main)のHeidelberg CFD CRISPR Library [HD-CFD]のメニューから検索・入手可能
  •  [*] CRISPRメモ_2019/05/15 #2 組織特異的CRISPR変異誘発実験の基盤となるショウジョウバエ・ライブラリを構築
6. [特許公開] 新奇な抗-CRISPR (Acr)の遺伝子とタンパク質、および、そのCRISPR-Casシステムの制御を介したバイテク応用
[出典] US20200040328A1. Novel anti-CRISPR (Acr) genes and proteins and methods of use.
公開日 2020-02-06; 発明者 Fremaux C, Horvath P, Romero DA, Moineau S, Hynes A, Rousseau G; 権利者 DuPont Nutrition & Biosciences, Université Laval (Quebec)
86種類のAcrの配列が列挙されている ; Acrsの同定法を含む
[関連記事] crisp_bio 2019-10-09 抗-CRISPRタンパク質AcrIIA6は、Cas9をアロステリックに阻害する; CRISPRメモ_2018/07/26 [#2] 毒性バクテリオファージの広範な抗-CRISPRタンパク質が、一連のCas9タンパク質を阻害する

7. CRISPR/Cas9を介してメタノール資化酵母Pichia pastorisの転写活性化因子MXR1の機能を解析
[出典] Targeted editing of transcriptional activator MXR1 on the Pichia pastoris genome using CRISPR/Cas9 technology. Hou C, Yang Y [..] Bai Z. Yeast 2020-02-12
  • 江南大学にWuxi Sinosbio Biomedical Technologiesが加わった研究グループが、Mxr1遺伝子のS215への変異誘発実験により、AOX1, DAS1, DAS2AOX5の転写制御機構の多様性を同定
8. [レビュー] CRISPR-Cas9技術の婦人科がんの研究への応用 
[出典] Applications of CRISPR-Cas9 in gynecological cancer research. Zhang W [..] Wang H. Clin Genet 2020-02-10
  • 華中科技大学同済医学院の研究グループが、子宮頸癌、卵巣癌および子宮内膜癌の研究や診断におけるCRISPR-Cas9技術の利用例をレビューし、課題と将来展望を論じた。
9. [レビュー] CRISPR-Cas9技術の敗血症研究への応用
[出典] Application of CRISPR/Cas9 technology in sepsis research. Wu M, Hu N, Du X, Wei J. Brief Funct Genomics 2020-02-10
  • 武漢大学などの研究チームが、CRISPR/Cas9システムの利点と限界、敗血症研究への応用、および治療戦略をレビュー
10. [レビュー] クラス2 CRISPR-Cas技術の最新動向
[出典] The rapidly advancing Class 2 CRISPR-Cas technologies: A customizable toolbox for molecular manipulations. Wang J, Zhang C, Feng B. J Cell Mol Med 2020-02-10
  • 香港中文大学などの研究チームが、タイプII (Cas9), タイプV (Cas12), タイプVI (Cas13)からBase Editorに至る技術とその利用をレビュー
11.  Perspectives in Biology and Medicine CRISPR特集号から
[出典] Perspectives in Biology and Medicine Volume 61, Number 1, Winter 2020 Edited by Neal Baer
  1. pp.   1- 13  Introduction to the Special Issue on CRISPR. George Q. Daley.
  2. pp.  14- 27 Commentary: Code Dread? Neal Baer.
  3. pp.  28- 43 How We Got to CRISPR: The Dilemma of Being Human. Rosemarie Garland-Thomson.
  4. pp.  44- 53 Focusing on Human Rights: a framework for CRISPR germline genome editing ethics and regulation. Kevin Doxzen, Jodi Halpern.
  5. pp.  54- 65 Who Goes First? Deaf People and CRISPR Germline Editing. Carol Padden, Jacqueline Humphries.
  6. pp.  66-72 Billy Idol. Ethan J. Weiss. 
  7. pp.  73- 92 CRISPR Cautions: Biosecurity Implications of Gene Editing. Rachel M. West, Gigi Kwik Gronvall.
  8. pp. 93-100 Who's Afraid of the Big Bad (Germline Editing) Wolf? R. Alta Charo.
  9. pp. 101-110 Clinical Germline Genome Editing: When Will Good be Good Enough? Helen C. O'Neill.
  10. pp. 111-125 Playing it Safe? Precaution, Risk, and Responsibility in Human Genome Editing. Sarah Chan.
  11. pp. 126-140 Genome Editing and Human Reproduction: The Therapeutic Fallacy and the "Most Unusual Case" Peter F. R. Mills.
  12. pp. 141-154 Shaping the CRISPR Gene-Editing Debate: Questions About Enhancement and Germline Modification. Josephine Johnston.
  13. pp. 155-176 CRISPR's Twisted Tales: Clarifying Misconceptions about Heritable Genome Editing. Marcy Darnovsky, Katie Hasson.
  14. pp. 177-194 Imperatives of Governance: Human Genome Editing and the Problem of Progress. J. Benjamin Hurlbut.
  15. pp. 195-206 The Existential Dimension to Aging. Tim Morris.
  16. pp. 207-217 "Lost Your Superpower"? Graphic Medicine, Voicelessness, and Georgia Webber's Dumb. Sathyaraj Venkatesan, Diptarup Ghosh Dastidar.

[出典] White Paper – A protocol for rapid detection of SARS-CoV-2 using CRISPR: SARS-CoV-2 DETECTR. Broughton JP, Deng W, Fasching CL, Singh J, Chiu CY, Chen JC.
Mammoth Bioscience (v1. 2020-02-15; v2 2020-02-18)

 Feng ZhangらのSHERLOCKに相次いで2020-02-15に、Jennifer Doudnaらが共同設立者であるMammoth BioscienceはCas12を利用するDETECTRに準拠したSARS-Cov-2 (COVID-19)の検出プロトコルを発表し、2020-02-18にversion 2へと更新した。
  • CODIV-19にチューニングしたDETECTRによって、患者由来サンプル由来RNAをRT-LAMP法で増殖に20分、Cas12aのssDNAコラテラル切断活性反応に10分2分待ってラテラルフロー・試験紙上で目視で判定となる。
  • Mammoth Bioscienceが公開したワークフローを同社のPDF資料Table 1から下図に引用した: Table 1
  • RT-LAMP法は栄研化学が開発した手法であり、RNAをDNA鎖に変換し増幅する手法である (栄研化学Webサイト参照)。
  • COVID-19のコピー数に応じた蛍光強度のグラフと試験紙上の結果、および、必要な器具の一覧をそれぞれPDF資料から左下図と右下図に引用した: 
Fig. 1 Equipment
  • Mammoth Bioscienceは、SHERLOCKおよび現行のCDC/WHOのワークフローとの比較結果も公開した (Appendox Figure 1から引用した下図参照): 
Comparison
  • このプロトコルは、FDA未認可であり、臨床診断への利用は不可
  • 問い合わせ窓口 diagnostics @ mammothbiosci.com 
[関連crisp_bio記事]

# 2020-02-15 11:00 am 初回投稿
[出典] 2020-02-14 Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: An open-acces SHERLOCK research protocolBroad Institute; McGovern Institute. (McGovern WebページはSHERLOCKの解説動画付)
[crisp_bio 2020-02-16追記] Jennifer Doudnaが共同設立者であるMammoth Bioscienceは2020-02-15に、Cas12を利用するDETECTRに準拠したSARS-Cov-2 (COVID-19)の検出プロトコルを発表した (crip_bio 2020-02-19)
  • [関連crisp_bio記事] crisp_bio 2018-02-23 CRISPRによる核酸検出・診断(DETECTRとSHERLOCK)
概要
 Feng ZhangOmar AbudayyehならびにJonathan Gootenbergの研究チームが、SHERLOCKに基づいて妊娠検査テストと同じような使い方ができる紙ベースでCOVID-19テストを可能とするプロトコルを、研究用に、公開した (32秒のYouTubeビデオ"SHERLOCK research protocol for COVID-19"参照)。


詳細
  • 研究チームはCOVID-19の合成RNAをモデルとして、2種類の配列シグナチャーを認識する2種類のcrRNAs (gRNAs)を設計・作出し、Cas13に組み合わせ、COVID-19 RNAの検出が可能なことを確認した。
  • 患者サンプルでの検証はこれからであり、研究所はこのプロトコルを、診断キット用プロトコルとしてではなく研究用プロトコル (research protocol)として発表したが、現在行われているqPCRテスト用に抽出されるのと同じRNAサンプルをテストすることができる。
  • 研究所は、COVID-19サンプルの解析に取り組んでいる研究者には米国に限らず、チームが相談にのり、また、スターターキットも提供するとしている。
  • サポートはコチラから: sherlock @ broadinstitute.org
  • プラスミドはZhang Lab Addgene repositoryから入手可能、その他の試薬は市販品
RNA抽出後のプロトコルは3ステップ60分 (大規模並列化可能)
  1. 抽出したRNAを、42℃等温遺伝子増幅25分
  2. Cas13タンパク質、gRNAおよびレポータ分子と37℃でインキュベーション30分
  3. 試験紙を浸けて待つこと5分
  4. 詳細プロトコル (今後、随時更新): A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics (v.20200214)
[crisp_bio注] SHERLOCK またはそれに準じた診断・治療ツールが多数開発されている。例えば: 
  • crisp_bio 2019-10-11 Cas13a-crRNAに基づく超高感度核酸検出システムSHERLOCKに標的ssRNAウイルス分解機能を付加
  • crisp_bio 2020-01-06 CRISPR-Cas13a超高感度核酸検出法を病原体の直接・高速・高感度・高特異性検出へと展開
[crisp_bio注] 米国CDCのCOVID-19検出キット
 米国CDCが700-800検体を同時判定可能なキット (Real-Time Reverse Transcriptase (RT)-PCR Diagnostic Panel)を急遽開発し配布をはじめると2月5日に発表したが、13日になって偽陰性の問題から回収した、と発表した:
[2020-02-16 COVID-19のヒト細胞侵入に必須のスパイク糖タンパク質の構造が報告された]
  • 2020-02-16 新型コロナウイルス (COVID-19)のスパイク糖タンパク質のクライオ電顕構造

  1. [Keap1遺伝子ノックアウト実験] CRISPR/Cas9-Induced Loss of Keap1 Enhances Anti-oxidation in Rat Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Hu Y, Liu S, Zhu BM (四川大学). Front Neurol 2020-02-18
  2.  [Cas12a (Cpf1) & Cas9; 標的配列に依存してオンターゲットの10倍を超える編集が発生するオフタゲートサイトが存在] Specificity profiling of CRISPR system reveals greatly enhanced off-target gene editing. Wang Y [..] Du Q (北京大学). Sci Rep  2020-02-10
  3. [マウスにおける条件付きノックアウト・アレル作成法] Consistent Production of Mice with Conditional Knockout Alleles by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing Using Two Guides/Two Oligos Approach. Golovko A et al. Cytology and Genetics 2020-01-18
  4. [細胞サーマル・シフト・アッセイによりCRISPR-Cas9ゲノム編集によるプロテオームの変化を捉える] Cellular thermal shift analysis for interrogation of CRISPR-assisted proteomic changes. Her NG [..] Nurmemmedov E. BioTechniques 2020-02-10
  5. [CRISPRシステムに対抗するファージ集団内の助け合い] [PREVIEW] In the Anti-CRISPR Jungle, Only the Weak Thrive? Croteau FR, Hynes AP. Cell Host & Microbe 2020-02-12; Exploitation of the Cooperative Behaviors of Anti-CRISPR Phages. Chevallereau A [..] Westra ER. Cell Host & Microbe 2020-02-12
  6. [オオタバコガで18種類のトリプシン遺伝子をCRISPR/Cas9でノックアウトしても、他のプロテアーゼ関連遺伝子の発現亢進を介して、プロテアーゼの総体としての活性は不変] Global gene expression changes induced by knockout of a protease gene cluster in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9. Wang M [..] Wu Y. J Insect Physiology 2020-02-12
  7.  [Cas9に金ナノ粒子DNAプローブを融合し、リステリア・モノサイトゲネス, GMOおよびアフリカ豚コレラウイルスの超高感度検出を実現] CASLFA: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9-Mediated Lateral Flow Nucleic Acid Assay. Wang X [..] Zhou X. ACS Nano 2020-02-11.
  8. [深層学習によるsgRNA活性予測: 畳み込みニューラルネットワークと双方向ゲート付回帰型ユニット・ネットワークのハイブリッドと転移学習によるsgRNA活性予測; 入力はコード化したsgNRA配列と4種類のエピゲノムデータ] C-RNNCrispr: Prediction of CRISPR/Cas9 sgRNA activity using convolutional and recurrent neural networks. Zhang G, Dai Z, Dai X. Comput Struct Biotechnol J 2020-02-12
  9. [Cas12aのコラテラル活性を利用してエビ・サンプルから腸炎ビブリオの有無を紫外光照射を介して裸眼により5分で判定可能に] Selective endpoint visualized detection of Vibrio parahaemolyticus with CRISPR/Cas12a assisted PCR using thermal cycler for on-site application. Zhang M [..] Wu J, Chen H. Talanta 2020-02-11
  10. [非ウイルス性デリバリー法] Direct Cytosolic Delivery of Proteins Through Co-Engineering of Proteins and Polymeric Delivery Vehicles (PPNC). Lee YW [..] Rotello VM. J Am Chem Soc 2020-02-12
  11. [プロトコル] Genome Editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 System. Culp E [..] Gupta BP. Biology Methods and Protocols 2020-02-10
  12. [プロトコル] Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9. Sinakevitch I, Kurtzman Z et alJoVE 2020-01-30
米国生物物理学会年会におけるCRISPR関連発表のタイトル - 6th Annual Meeting of the Biophysical Society (2020 Feb 15-19, San Diego)
  1. Biophysical Journal. Feb 07, 2020 Volume 118,Issue 3, Supplement 1, S1-626.
  2. Mapping the Boundary of DNA Unwinding in CRISPR-Cas9 Target Recognition
  3. Very Fast CRISPR on Demand
  4. Direct Observation of CRISPR-Cas12 Conformational Sampling by SM FRET and Cryo EM Reveals how Conformational Activation Promotes Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity
  5. Real-Time Observation of DNA Cleavage by CRISPR-Cas9 Endonuclease Using Pyrene Molecule as a Sensitive Probe for Detecting SUB-NM Structural Change
  6. Cardioprotection Conferred by a CRISPR/Cas9 Single Amino Acid Substitution of NCX1 (H165A): the PH Insensitive NCX Mouse
  7. Probing the RyR2 Ca2+ and Caffeine Binding Sites by Mutagenesis in Human Stem-Cell Derived Cardiomyocytes by CRISPR/Cas9 Gene Editing
  8. Crystal Structure of an Anti-CRISPR Protein, AcrIF2, and its Interaction With Type IF Cas Proteins
  9. Two-Metal Ion Mechanism of DNA Cleavage in CRISPR-Cas9
  10. A Catalytically Enhanced Type II-C Cas9 through Directed Protien Evolution

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