カテゴリ: PDIS事業成果

[出典] CF-PA2Vtech: a cell-free human protein array technology for antibody validation against human proteins. Morishita R [..] Sawasaki T. Sci Rep. 2019-12-18.

 抗体は、ペプチド、タンパク質および化合物といった特定の分子の検出に広く使われているが、標的分子に対する特異性には課題を残しており、抗体を使った実験データの信頼性を高める努力が続いている [1-3]。セルフリーサイエンス社と愛媛大学プロテオサイエンスセンターの研究グループは今回、抗体の品質を効率よく同定可能とする技術、CF-PA2Vtech、を開発し、その性能を抗HA抗体と抗PD-L1抗体の交叉反応性の同定で実証した。
  • 研究グループは、ヒト全長cDNAsのN末端にFLAG-GST (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)を融合し、コムギ胚芽無細胞 (Cell Free: CF)タンパク質合成技術 (生化学, 2007)に基づいて19,712種類のヒト組換えタンパク質を合成した上で、10~14種類のタンパク質を混合し、グルタチオンを表面に結合させた磁気ビーズと強力なマウネットプレートを介して、384ウエル x 12枚または1,536ウエル x1枚のプレートのウエルに固定したタンパク質アレイ (Protein Array: PA) を構築していた[Figure 1の一部引用下図A/B/C参照]Figure 1  part
  • 研究グループは今回、このPAに基づいて抗体 (Antibody: A)の特性評価 (Validation: V)する技術 (technology)を確立し、CF-PA2Vtech、として発表した
  • 市販の抗-HA抗体 (TANA2, MBL)または抗-PD-1抗体(D4W2J, Cell Signaling Technology) をモデルとして実証実験を行い、PAからそれぞれ、13種類と3種類のヒトタンパク質と結合することを見出し [抗-HA抗体についてTable 1引用下図参照]、この交叉反応性を免疫ブロット法で裏付けた。Table 1
  • CF-PA2Vtechでは全てのタンパク質が全長cDNAに紐付けられていることから、設計されたエピトープの配列との相同性検索から交叉反応したタンパク質のエピトープ候補配列を推定し、続いて、アラニンスキャニングにより、それらがエピープであることを裏付けた。
  • 抗-PD-1抗体(D4W2J)の場合、エピトープは残基Ala274を囲むペプチド (•••GPRSAQPLR•••) とされているが、Figure 4/Table 2引用の下図にあるように、PD-1であるClone-4の他のClone-1, -2および-3のエピトープ候補は、SAQそしてまたはRxAQの配列を帯びていた。研究グループは、アラニンスキャニングの結果も受けて、抗-PD-1抗体(D4W2J)は、主としてRxAQ配列をエピトープとして認識するとした。Fig. 4- Tab 1
「抗体の品質」関連crisp_bio記事
crisp_bioブログのカテゴリ「PDIS事業成果」の意味:PDISは創薬等支援技術基盤プラットフォーム事業の略称であったが、この事業終了後のAMEDにおける後継プロジェクトに由来する成果も「PDIS事業成果」にカテゴライズ。

[出典] Incorporation and influence of Leishmania histone H3 in chromatin. Dacher M [..] Kurumizaka H. Nucleic Acids Res. 2019-11-13;  [構造情報] PDB ID - 6KXV LmaH3 nucleosome (2019-11-19 公開待ち)

 東京大学、がん研究会、早大ならびに東工大の研究グループは今回、GFPで標識したリーシュマニア (Leishmania major)のヒストンH3 (LmaH3)を、PiggyBacトランスポゾンによりヒト細胞内で異所的に発現させ、LmaH3がヒト細胞 (HeLa)のクロマチンに取り込まれることを示した (Figure 1 (B), (F)引用下図参照)。LmaH3 HeLa
[背景]
  • 寄生原虫リーシュマニアはサシチョウバエ類によって媒介されて脊椎動物に感染し、マクロファージ内で増殖し (Wikipediaのリーシュマニアの項から引用した下図参照)、リーシュマニア症を引き起こすが、宿主の自然免疫応答を回避する分子機構は不明であった。一方で、近年、病原体が宿主のエピゲノムをハイジャックする事例が報告されてきた。Leishmania
  • これまでに、宿主細胞の免疫システムを障害する因子の同定を目的として、リーシュマニアが宿主細胞にて分泌する因子の同定が種々試みられてきたが、興味深いことに、しばしばヒストンが同定されてきた。また、トリパノソーマやマラリア原虫といった寄生原虫もヒストンを分泌すると報告されてきた。
  • 4種類のヒストン (H2A、H3B、H3およびH4)が、真核細胞のクロマチンの基本単位であるコア複合体'ヌクレオソーム'を形成し、~150 bpのDNAが巻きつくことで、遺伝子発現を調節する構造基盤を構成する。ヒストンには多様な変異体が存在し、それぞれに独特なクロマチン構造をもたらす。ヒストンの生物種間での保存性は比較的高いが、その中で、リーシュマニアとヒトのヒストンの同一性は48-60%に止まる (酵母とヒトのヒストンの同一性は80-92%)。したがって、仮にリーシュマニアのヒストンが、宿主染色体に取り込まれれば、宿主のクロマチンの構造ひいては宿主細胞の遺伝子発現に大きな影響を及ぼす可能性が高い。
[成果]
  • LmaH3と、ヒトのヒストン3種類 (H2A, H2BおよびH4)からなるヌクレオソームを再構成し、その結晶構造を決定した (PDB ID 6KXV)。
  • LmaH3を帯びたヌクレオソームはヒトH3.1を含むヌクレオソームよりも不安定であった。変異誘発実験から、ヒトH3.1の残基Tyr41、Arg63およびPhe104に相当するLmaH3の残基Trp35、Gln57およびMet98が、LmaH3の不安定性をもたらし、LmaH3がヌクレオソーム内でH3-DNA間の相互作用をヒトH3.1から弱めることが示唆された。
  • さらに、沈降速度アッセイから、LmaH3を帯びたクロマチンは、DNAが帯びている負電荷を打ち消すMg2+によるクロマチン凝縮促進に抵抗し、オープンなコンフォメーションを維持することも見出した (Figure 6引用下図参照)。LmaH3
  • リーシュマニアから分泌されるタンパク質として、ヒストン・シャペロンのNapタンパク質も高頻度で見られ、NapがLmaH3のヒト・ヌクレオソームへの組み込みを促進する可能性がある。
  • LmaH3を含むヌクレオソームは、リーシュマニア症に対する治療標的の可能性を秘めている。

[出典] FRET-assisted photoactivation of flavoproteins for in vivo two-photon optogenetics. Kinjo T, Terai K [..] Matsuda M. Nat Methods 2019-09-09

背景
  • 光誘導・光活性化二量体形成 (light-induced/light-activated dimerization; LID/LAD)技術の開発によって、光操作によるタンパク質間相互作用ひいてはシグナル伝達経路の調節と解析が可能になった。例えば、シロイヌナズナ由来の光受容体フラボタンパク質クリプトクロム2 (CRY2)と同じくシロイヌナズナ由来のCIB1またはCIB1変異体CIBNのセットにより、青色光照射によって、CRY2を融合したタンパク質と、CIB1/CIBNを融合したタンパク質の、細胞内での相互作用の可視化が可能になった。
  • 一方で、2光子励起顕微鏡 (2P excitation microscopy: 2PEM)の開発によって、生体組織の深部の可視化も可能になった。
成果

 京都大学を主とする研究グループは今回、2P励起によるCRY2の活性化効率が極めて低いことを見出したが、CPY2の2P励起の効率を高める技術を開発してCRY2の2P励起を実現し (2P-activatable CRY2: 2paCRY2)、2paCRY2と2PEMによる細胞/組織内でのシグナル伝達の調節と解析を実現した。

 2paCRY2は、CRY2の光回復酵素相同領域 (CRY2PHR (photolyase homology region))に、リンカーを介してmTagBFP2を連結した構成であり、mTagBFP2が2P励起のエネルギーを吸収し、Förster共鳴エネルギー移動(FRET)を介してCRY2PHRに含まれている青色光吸収余因子であるフラビンアデニンジヌクレオチド (flavin adenine dinucleotide: FAD)に効率良く移動する仕組み (FRET-assisted photo activation: FRAPA)に基づいている。
  • 2paCRY2にRAF1タンパク質を結合した2paRAFを介して、3次元細胞培養系において、シングルセル分解能で、2P励起によって細胞外シグナル調節キナーゼ (Extracellular Signal-regulated Kinase: ERK)活性化を実現。
  • 2paRAFを発現させたマウス皮膚においても、ERKの2P励起を実現し、また、ERKの細胞間伝播の追跡も実現。
  • さらに、FRAPAを他のフラボタンパク質にも展開可能なことを、mTFP1とLOVドメインに基づく光誘導性核外移行因子 (light-inducible nuclear exporter: LINX)の組み合わせ2paLINXが、2p励起によって細胞核から細胞質へ移行することで、実証。

[出典] "MAFFT-DASH: integrated protein sequence and structural alignment" Rozewicki J, Li Songling, Amada KM, Standley D, Katoh K. Nucleic Acods Res. 2019-05-07
  • 2002年にClustalWT-Coffeeよりも高速であり、今やClustalWのオリジナルWebサイトでも'For DNA alignments we recommend trying MUSCLE or MAFFT'と紹介されているマルチプル配列アライメント (multiple sequence alignment, MSA)ツール、MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform)を発表した加藤和貴 (当時 京大、現 阪大微研)らは、今回、MAFFTに構造アライメントを統合した解析環境MAFFT-DASHを公開 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)するに至った。
  • DASHは、Protein Data Bankに登録されている全てのタンパク質を対象としたドメインとチェインの構造アライメントの結果を蓄積したWebベースのデータベース (web-based Databae Aligned Structural Homologs)である。2019年4月4日更新時の規模が、441,111チェイン, 56,848,571のチェイン・アライメント, 169,937ドメインおよび94,062,584ドメイン・アライメント、となっている。
  • MAFFT-DASHの検証は、ベンチマークデータセットを提供しているBAliBaseHomFamOXFamMattbenchおよびSISY- PHUSから選択した878セットに基づいて行われい、MAFFT-DASHのMAFFTからの性能向上が実証された。すなわち、参照アライメント結果との一致度を見る指標 Sum-of-Pairs(SP)にて、類似性が弱い配列間でのアライメントについて、MAFFT-DASHはMAFFTから10-20%の向上を示した。
  • また、MAFFTアライメントに相同配列を加えると、アライメント結果がさらに改善された。
  • MAFFT-DASHを利用することで、リモートホモロジーの検出を介して、タンパク質構造のホモロジーモデリングのテンプレートとして利用可能な構造既知タンパク質の範囲が広がる。
  • 下図は、MAFFT単独のアライメントでは検出できなかったリモートホモロジーから構造上保存されていた触媒アミノ酸をMAFFT-DASHアライメントによって同定した事例 (Figure 1から引用)MAFFT-DASH.

[出典] "Crystal structure of a mammalian Wnt–frizzled complex" Hirai H, Matoba K, Mihara E, Arimori T, Takagi J. Nat Struct Mol Biol 2019-04-29;[PDB登録構造情報] 6AHY: Wnt signaling complex

背景 (原論文 Introductionに準拠)
  • Wntファミリーのタンパク質は細胞外分泌糖タンパク質であり、器官形成、組織再生、癌化などの細胞機能を制御する。Frizzled (Fz)ファミリーのタンパク質は、7回膜貫通タンパク質であり、そのN末端領域 (NTD)のシステインチッリドメイン (CRD)を介してWntタンパク質に結合し、Wntタンパク質のプライマリー受容体として機能する。
  • 古典的Wnt経路 (β-カテニン経路)においては、Fzとは異なる細胞表面タンパク質であるLDL受容体のLRP5またはLRP6が、Wntの補助受容体として機能する。これら、Wnt、Fz、およびLRPの三者の間の相互作用の構造基盤の解析は、共有結合性脂質修飾によりWntタンパク質が強い疎水性を帯びていることから容易ではなかった。
  • 2012年になってようやく、Jandaらが (Science, 2012) Xenopus Wnt8 (xWnt8)とマウスFrizzled-8 (Fz8)-CRDとの複合体構造(PDB 4F0A) を発表し、続いて2013年にChuらが (Structure, 2013)によるショウジョウバエのWntD N末端ドメインの構造 (PDB 4KRR)を発表した。
  • しかし、xWnt8とWntDは、Wntファミリーの~19種類のタンパク質の中でも、ジスルフィド結合サブドメインを含むN末端ドメイン (NTD)を欠失した非典型的タンパク質であったため、これまで、哺乳類Wntタンパク質の精密なホモロジーモデリングまでに至らなかった。
  • 阪大蛋白研の高木研究室は今回、ヒトWnt3 (hWnt3)の結晶化を実現しX線結晶構造解析に成功し、hWnt3に近縁のマウスWnt3a (mWnt3a)にて、タンパク質領域の機能解析を進めた。
成果
  • hWnt3とmFz8のコンストラクトの徹底的な最適化と様々な化学修飾を経て高発現、高可溶性およびサンプルの一様化を実現し、リジンメチル化および脱グリコシル化したhWnt3とmRz8 CRD複合体の結晶を得て、分子置換法によるX線結晶構造解析により、分解能 2.8 Åの構造を得た (RCSB PDBのNGL Viewerからキャプチャーした下図左参照;下図右はxWnt8の構造)。Wnt
  • Cα原子鎖のr.m.s.dからみてhWnt3の構造はxWnt8の構造に重なった。また、mFz8との結合がxWnt8と同様に2ヶ所のサイトでの相互作用に依存し、3種類のプロトマーの構造情報からも、hWnt3がmFz8と結合後も揺れ動くことが示唆された。
  • 一方で、hWnt3が結合したmFz8 CRDは、xWnt8が結合したmFz8 CRDと異なり、複合体結晶内で対称二量体を形成していることを見出した。この二量体化は、hWnt3に結合したCRDが互いに不飽和アシル鎖の先端を交換することで実現されていた。こうして、X線結晶構造解析からhWnt3とmFz8が2:2の複合体を形成することが明らかになったが、溶液中でも濃度依存で2:2複合体を形成することが、結晶化前のゲル濾過プロファイリングまた後述のmWnt3aの実験から、明らかになった。
  • 今回得られたhWnt3の構造をもとにして近縁のmWnt3aの6ヶ所へのPAタグ挿入を実現し、PAタグ挿入変異体によりmWnt3aの各領域の機能解析を試みた。
  • PAタグ挿入実験の結果も参照して、mWnt3aの極めて柔軟な'linker'領域(上図hWnt3/mFz8-CRD複合体の構造の左上)が、βヘアピンを形成してFrizzled結合界面から反対側突き出す構造をとり、mWnt3aの補助受容体への結合を可能にしていることが示唆された。
  • 表面プラズモン共鳴解析を介してWnt3が補助受容体LRP6に直接結合することを確認し、WntとFz受容体との結合に始まるmWnt3a-mFz8Fz-LRP6三者複合体形成機構のモデル構築に至った (原論文Fig. 4-h参照)。

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