タグ:エピゲノム

[出典] Epigenome editing strategies for the functional annotation of CTCF insulators. Tarjan DR,lavahan WA, Bernstein BE. Nat Commun. 2019-09-18.

背景
  • ゲノム上で機能的に互いに隔離された遺伝子発現調節ユニットであるループ状の形状をとるTADs (topologically-associated domains)は、DNA結合インシュレータタンパク質CTCFによって隔離されている。このゲノムの三次元構造と遺伝子発現制御ひいては疾患との関連については、近年、CRISPRゲノム編集技術による解明が進み始めた [1-3]
  • MGH-HMS/Broad Instituteの研究チームは今回、CTCFが結合するDNA部位のCRISPRゲノム編集技術による改変に替えて、CRISPRエピゲノム編集技術によってCTCFを然るべき結合部位から排除することで、CTCFの機能解析が可能なことを実証した。
概要
  • 原論文Fig. 1aを引用した左下図にあるように、dCas9、dCas9-KRABおよびdCas9-DNAメチル基転移酵素 (dCas9-DNMT3A, dCas9-DNMT3A3L)を、CTCF結合部位を標的とするsgRNAに組み合わせることで、それぞれの因子によるCTCF排除効果を確認した。

    Epigenome editors 1a Epigenome editors 1bc
dCas9-KRABの効果
  • はじめに、原論文Fig. 1b/cから引用した右上図にあるように、HEK293細胞において、グリオブラストーマのオンコジーンとされているPDGFRA遺伝子座をモデルとして実験を行った。PDGFRA遺伝子座のインシュレーター領域に20 bpの間隔で位置している2ヶ所のCTCF結合サイトのうち、TAD内部に近いサイト (右上図のP1)のCTCF結合モチーフを標的*とするsgRNAに基づくdCas9-KRABの効果をChIP-seqによるゲノムワイドで解析した (* 結合特異性をより高めるために近接する8塩基を加えた配列)。
  • インシュレーター部分に注目すると、P1サイトに結合しているCTCFレベルの低減 (CTCF排除の効果)が83%に達し、P1サイトを含む周辺3 kb領域におけるH3K9me3亢進が見られた (なお、Cas9に同一のsgRNAを組み合わせたCTCF結合モチーフ削除は、CTCFレベルの81%減をもたらした)。
  • 一方で、P1サイトよりも20 bp上流のCTCF結合サイトに結合したCTCFのレベルとH3K9me3レベルにはコントロールとの違いが見られなかった 。ゲノムワイドに存在するその他~60,000ヶ所のCTCF結合サイトについても、CTCFレベルにコントロールとの違いは見られず、dCas9-KRABの高い選択性が示された。
  • 続いて、PDGFRAの他のオンコジーン、OLIG2, TAL1, およびLMO2のインシュレーターにおける10ヶ所のCTCF結合サイトを標的とするsgRNAを使用した実験において、10ヶ所のうち8ヶ所においてPDGFRAと同様なCTCFレベル低下を確認した。
  • 次に、dCas9-KRABの効果とdCas9単独の効果を比較し、CTCFレベル低減は、主としてdCas9の標的サイトへの結合に因り、KRABによるクロマチン抑制効果が従であることを明らかにした。
  • さらに、dCas9-KRABを一時的に発現させ、dCas9-KRABの発現が見られなくなる12日目まで継代培養した上で測定を繰り返したところ、CTCFレベルとH3K9me3レベル共に、コントロールと同レベルに戻っていたことから、より安定して細胞分裂後の娘細胞にも編集結果が継承される手法を探るに至った。
dCas9-DNMT (dCas9-DNMT3AとdCas9-DNMT3A3L)の効果
  • dCas9-DNMTを3日間発現させたところ、CTCF結合モチーフの20-40%がメチル化され、また、DNMT3A3Lがより効果的であった。CTCFレベル低減効果の持続性については、12日間継代培養後も、DNAメチル化が~20%維持され、CTCFレベルも20%低減が維持されていた。
  • さらに、dCas9-KRABによるH3K9me3にdCas9-DNMTによるDNAメチル化を続けるいわゆる'hit-and-run'遺伝子サイレンシング戦略を試行し、特に、dCas9-KRAB/dCas9-DNMT3A3Lの組み合わせによって、顕著なDNAメチル化亢進とCTCFレベル低減が実現し、27日の継代培養において、12日後に効果がピークに達したが、27日後にも効果が維持されることを見出した。
CRISPRエピゲノム編集によるインシュレーター破壊による癌細胞モデリング
  • PDGFRAが低発現しそのインシュレーターが維持されいるグリオブラストーマ細胞株 GSC6をdCas9-KRABにて編集し、P1サイト結合CTCFレベルが95%低減し、20 bp離れたCTFC結合サイトに結合するCTCFレベルには変化が見られないことを確認した。
  • さらに、PDGFRA遺伝子座のCRISPRエピゲノム編集によるインシュレーター破壊が、PDGFRAオンコジーンのスーパーエンハンサーの要素も含む隣接するTADと長距離間相互作用を可能とし、インシュレーター欠損から癌発生に至る分子機構解明のツールとして利用可能なことも確認した (原論文Fig. 3引用下図参照)。Epigenome editors 3

[関連crisp_bio記事]


[出典] "Engineering Epigenetic Regulation Using Synthetic Read-Write Modules" Park M, Patel N, Keung AJ, Khalil AS. Cell. 2018-12-02.

概要
  • Ahmad S. KhalilらBoston UniversityとNorth Carolina State Universityの研究チームは今回、DNAとヒストン・タンパク質のエピジェネティック・マークの書き込み因子 (writers)と読み出し因子 (readers)からなるエピゲノム調節ネットワークに倣って、エピジェネティック・マークN6-メチルアデニン (m6A)のwriterとreaderからなる人工エピジェネティックスを設計・作出し、ヒトHEK293FT細胞においてその機能を実証した。
  • 本研究はまた、動物では稀なエピジェネティック・マークm6A (参考論文*参照)を利用した人工エピジェネティクスが、脊椎動物全般に見られるシトシンの5位のメチル化 (5mC)に基づく内在エピジェネティクスと直交する (相互干渉しない)とした研究チームの仮説が成立し、内在エピジェネティクスに新たなエピジェネティクスの階層を付加することが可能になったことを、意味する。
合成モジュールと機能 (2018-12-11追記 "Cell at CellPressからの関連ツイート"参照)
  • イニシエータモジュール(synthetic initiator module, synI):ヒトゲノムに組み込んだレポーター遺伝子座の20-bpの長さの合成DNA配列 (binding sequence, BS) を認識しGATCモチーフのアデニンをメチル化;BS結合ドメインを帯びたジンクフィンガー (ZF)タンパク質とE. coli DNAアデニン・メチル基転移酵素Damのwriterドメインで構成;アブシン酸ABI1 とその受容体PYL1の結合を利用した誘導可能なsynlさらに、BS-ZFをsgRNA-dCas9に替えたsynlも開発して可用性を拡大
  • 読み出しモジュール (readout module, synR):メチル化GATCを認識するStreptococcus pneumoniae DpnI由来のreader domain (RD)と転写エフェクタードメイン (EDs:転写活性化ドメインVP64または転写抑制ドメインKRAB)で構成
  • 読み書きモジュール (read-write module, synRW):すでに存在するm6Aマークを認識し近位のGATCモチーフへとメチル化を伝搬させる;Dpnl m6A RDDam writerドメインで構成;多重なGATCを組み込んだレポーター遺伝子座で検証;dCas9版synIにより、両方向への伝搬も実現;synRWを介してエピジェネティク・メモリーも実現
*) 参考文献:マウスES細胞におけるm6Aの存否を巡る論文
Cell at CellPressからの関連ツイート

[RESEARCH HIGHLIGHTS]“What comes first—genomic structure or function?” Rusk N. Nat Methods. Published online 31 August 2017.
[Article]“Manipulation of nuclear architecture through CRISPR-mediated chromosomal looping.” Morgan S et al. Nat Commun. 2017 Jul 13;8:15993.
  • 染色体のループ形成を操作可能とするツールCLOuD9を開発:ゲノム上の標的位置に結合するdCas9-sgRNAシステムに、植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)シグナル伝達機構の一部を組込むことで実現;挿入図Figure 1-aにあるように、S. pyogenes dCas9にABA受容体PYL1とHAタグを、S. aureus dCas9にABI1ドメインとFlagタグを、それぞれ融合し、互いに直交するdCas9-sgRNAペアが染色体上の2箇所の標的部位にそれぞれ結合した後、ABAを加えることでPYL1とABI1の近接結合を誘導し(Chemically induced proximity、CIP)、Sp-dCas9とSa-dCasのヘテロ二量体化ひいては、染色体上の任意の遺伝子座を近接させる。
CLOuD9
  • ヒト慢性骨髄性白血病由来K562細胞とヒト胎児由来腎臓上皮細胞由来293T細胞において、ABAの付加と除去によるβ-グロビンのプロモーターと遺伝子座制御領域(LCR)の間の可逆的ループ形成を実現した。しかし、K562ではβグロビンの発現が亢進下が、293T細胞でのβグロビン発現には変化が見られなかった。
  • 293T細胞では、転写因子Oct4のプロモーターと遠位の5末端エンハンサーの間に接点が見られずOct4が発現していない。しかし、CLOuD9によりプロモーターとエンハンサーのコンタクトを生成することでOct4を強制発現することができた。
  • K562では、ABAによるCIPを10日間継続後は、ABAを除去しても、染色体ループが維持され、これは、コヒーシンやCTCFではなくRNAヘリカーゼDDX5とDDX17に拠る現象であることも見出した。
 参考Webサイト
  • クロマチン構造の遺伝子発現制御解析に CLOuD9 Gene Expression Regulation Kit. Funakoshi

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/02/06

  • Corresponding author: 胡桃坂仁志 (早稲田大学)
  • 紫外線によって隣り合うピリミジン塩基が架橋すると、CPD(cyclobutane pyrimidine dimer)と6-4PPs (pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproduct) と呼ばれるDNA障害に至る.この障害を修復するのがヌクレオチド除去修復(Nucleotide excision repair: NER)である.
  • 哺乳類NERのサブパスウエイにおいて光障害を認識するタンパク質として、UV損傷DNA結合タンパク質(UV-DDB;DDB1-DDB2 (XPE))と、XPC複合体(XPCタンパク質-RAD23-centrin2 ヘテロ三量体)が知られている.XPCは6-4PPを含む損傷によって歪んだヘリックスを広汎に認識するが、その構造基盤が明らかにされている.一方で、UV-DDBは紫外線損傷を特異的に認識し、XPCを損傷部位へリクルートする.今回その構造基盤を明らかにした.
  • 対称的な位置2カ所にCPDが存在するdsDNAを合成し、CPDヌクレオソームをin vitro 再構成し、X線結晶構造解析を行った.
  • CPDの場合は6-4PPと異なり、損傷を受けた塩基がdsDNA内に収まっており、XPCが認識可能なDNA骨格の歪みが損傷部位周辺に発生していなかった.
  • 損傷を受けたチミン塩基の一つは損傷を受けなかったアデニン塩基から3.0Å以内に位置し、ヌクレオソーム内で部分的なワトソン・クリック型の水素結合が維持されていることが示唆した.
  • NERパスウエイが活性化する初期段階でCPDに結合するUV-DDBが、ヌクレオソーム中のCPDに特異的に結合することを確認した.

1.       CRISPR-dCas9により選択的かつ可逆的クロマチンループ形成を実現

[出典]Morgan SL Wang KC (Stanford U). “Manipulation of nuclear architecture through CRISPR-mediated chromosomal looping” Nat Commun. 8, Article number: 15993. Published online:13 July 2017
  • 2遺伝子座を可逆的に並置(図1-a)させるツールCLOuD9を、CRISPR-dCas9技術と、哺乳類細胞には存在しない植物のアブシン酸(S-(+)-abscisic acidABA)ストレス応答シグナル伝達経路に倣った化学誘導接近(Chemically induced proximityCIP)技術を組み合わせて実現
  • 1-bにあるように2種類のCLOuD9コンストラクト、gRNA-SpdCas9-PYL1(CSP)gRNA-SadCas9-ABI1(CSA)、をレンチウイルスで送達後、ABAを加えることでPYL1ABI1の結合を誘導し、CSPの標的遺伝子座とCSAの標的遺伝子座を近接させ、ABAをウオッシュアウトすることで、2遺伝子座は内在状態へと戻る。CLOuD9
  • 発生段階に応じてサブユニットをコードする遺伝子群が変化していくことが知られているβグロビンの遺伝子座制御領域(Locus Control Region: LCR)を標的として、K562細胞とHEK293細胞で実証


2.       逆転写酵素(RTs)を介したRNA断片獲得機構を伴うCRISPR-Casシステムの進化系統解析

[出典]Silas S Koonin EV (NCBI), Fire AZ (Stanford U). “On the Origin of Reverse Transcriptase-Using CRISPR-Cas Systems and Their Hyperdiverse, Enigmatic Spacer Repertoires.” mBio 2017 Jul 11;8(4):e00897-17.
  • Cas1インテグラーゼはCRISPR Cas獲得免疫システムにおいて、外来DNAから獲得したスペーサをCRISPRアレイに組み込む鍵となる酵素であるが、隣接したグループⅡイントロン関連逆転写酵素(RTs)と融合している例が存在するが、最近RT-Cas1融合蛋白質がRNAからスペーサを獲得することが見出された。
  • 進化系統解析によるとRTCas1のドメインは共進化し、RTはほとんどのタイプⅢ CRISPR Casシステムに存在するが、その進化系統分類体系はCRISPR Casのタイプの分類体系には沿っていない。
  • 産業上有用なシアノバクテリアArthrospira platensisにはRT-Cas1を伴うタイプⅢシステムとRTを欠いているタイプⅢシステムが共存しており、双方のシステムで獲得スペーサ群を解析したところ、RTを欠いたシステムのスペーサには相当する既知のウイルスまたはバクテリアの遺伝子が存在したが、RTを伴うシステムのスペーサに相当する遺伝子を網羅的な遺伝子データベースからも見いだすことができなかった。


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