タグ:エピゲノム編集

1. CRISPR/dCas9によるエピゲノム編集ツールを利用して、Fgf21遺伝子プロモーターのDNA脱メチル化を実現
[出典] "Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing" Hanzawa N, Hashimoto K [..] Ogawa Y. Sci Rep 2020-03-20
  • 東京医科歯科大学の橋本貢士と小川佳宏らは先行研究で、マウス乳仔期の肝臓において、線維芽細胞増殖因子21 (FGF12)が、肝臓での脂質代謝を制御する核内受容体PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor α)依存で脱メチル化を受けること、および、リガンド結合によるPPARαの活性化を介して、DNA脱メチル化ひいてはFGF12の発現が亢進することを報告していた。
  • 研究グループが利用したエピゲノム編集ツールは、CRISPRaの一種であるSunTagシステムに準拠して [*]、dCas9に、22 aaの長さのリンカーを介して、5連のGCN4 -  単鎖可変領域フラグメント (scFv) - 脱メチル化酵素TET1の触媒ドメイン (TET1CD)を結合した人工因子である [Figure 1 引用下図 a 参照]。DNA demethylation 2020-03-28 21.44.07
  • Fgf21のプロモーター領域を標的とするこの人工因子によって、マウス肝癌細胞株Hepa1-6とPPARα欠失マウスにおいて、それぞれ、PPARαの合成リガンド投与と断食をキューとするFgf21のDNAメチル化低減を介して、Fgf21の発現が亢進することを示した。
  •  [*] CRISPR関連文献メモ_2016/09/03 #2 [論文] 脱メチル化によって標的遺伝子を特異的にin vivo 活性化するCRISPR/Cas9ツールボックスを開発
2. Cdk5遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9と抗癌剤を共に、弱酸性pH応答性ナノ粒子でデリバリすることで、腫瘍微小環境を'cold'から'hot'へ改変
[出典] "Reshaping tumor immune microenvironment through acidity-responsive nanoparticles featured with CRISPR/Cas9-mediated PD-L1 attenuation and chemotherapeutics-induced immunogenic cell death" Tu K [..] Zhang Z. ACS Appl Mater Interfaces 2020-03-20
  • 表題のデリバリー法により、CRISPR/Cas9によるCdk5 (サイクリン依存性タンパク質キナーゼ5)のノックアウトを介したPD-L1発現抑制に、パクリタキセルによる免疫応答を引き起こす細胞死 (immunogenic cell death: ICD)の誘導、Tregの抑制、腫瘍随伴マクロファージの再極性化、および抗腫瘍免疫応答の亢進の効果が加わり、腫瘍成長が効果的に抑制され、全生存期間が伸びるに至った。
3. ヌクレオソーム枯渇‘mini’U6 Pol IIIプロモーターを介して多重sgRNAsによるCRISPR/Cas9遺伝子編集を実現
[出典] "'Mini'U6 Pol III promoter exhibits nucleosome redundancy and supports multiplexed coupling of CRISPR/Cas9 effects" Preece R, Georgiadis C, Gkazi SA et al. Gene Ther 2020-03-20
  • RNAポリメラーゼ III (Pol III)は、短鎖ノンコーディングRNAsを発現し、CRISPR sgRNAの発現にも利用され、Pol IIIのH1とU6を組み込んだベクターはゲノム編集療法に利用されている。英国の研究グループは今回、
  • レンチウイルスのLTR領域に表題U6プロモーターを埋め込むことで、高レベルの転写活性を実現した。さらに、‘mini’H1とU6の二重プロモーターを介した二重sgRNAs転写によりTCRとHLA分子の同時破壊を実現し、ユニバーサルCAR T細胞の効率的作出の可能性を示した。
4. [レビュー] 抗-CRISPRタンパク質の分子機構は多彩である: 氷山の一角?
[出典] "Diversity of molecular mechanisms used by anti-CRISPR proteins: the tip of an iceberg? " Hardouin P,  Goulet A. Biochem Soc Trans 2020-03-20
  • CRISPR-Cas獲得免疫機構の各ステップに干渉する分子機構に注目し、オルソステリックな阻害、アロステリックな阻害、CRISPR-Casコンポーネントを非可逆的に改変する酵素活性などの多彩な分子機構をレビュー
5. CRISPR関連研究の最新動向ハイライト - 主として2017-2019年に刊行された論文の簡潔な紹介
[出典] "Recent advances in CRISPR research" Chen B [..] Li W. Protein & Cell 2020-03-21
  • SpCas9変異体作出およびホモログの発見; 塩基エディティング; dCasイメージング; 植物育種への応用; 動物の育種と疾患モデル動物の作出; Ex vivo/in vivo遺伝子編集による療法研究
6. ディスレクシア, 自閉症, アルツハイマー病に関連するDip2aホモ型ノックアウトmESC株IBMSe001-A-1を樹立
[出典] "Generation of Dip2a Homozygous Knockout Murine ES Cell Line IBMSe001-A-1 via CRISPR/Cas9 Technology" Yao M [..] Wu C, Zheng Y. Stem Cell Res 2020-03-19

7.  殺虫活性を帯びた3種類のBt毒素に対する農業害虫シロイチモジヨトウの候補受容体5種類を、CRISPR KOスクリーンで評価
[出典] "Evaluation of five candidate receptors for three Bt toxins in the beet armyworm using CRISPR-mediated gene knockouts" Huang J et al. Insect Biochem Mol 2020-03-19
  • 3種類のBt毒素と5種類の受容体との相互関係明らかに: 毒素Cry1AcとCry1Faに対して受容体のABCC2が主にCad1が従に応答する; ABCC2はCry1aにも応答する。

[出典] "Casilio-ME: Enhanced CRISPR-based DNA demethylation by RNA-guided coupling methylcytosine oxidation and DNA repair pathways" Taghbalout A [..] Cheng AW. bioRxiv 2019-05-19. >> Nat Commun. 2019 Sep 20;10(1):4296
  • The Jackson Laboratory for Genomic Medicine (JAX)とUniversity of Connecticut Healthの研究グループは今回、A W Cheng (JAX)らが先行研究*で開発したCasilio法に基づいて、DNA脱メチル化を亢進するCasilio-DNA Methylation Editing (Casilio-ME)プラットフォームを開発した (*先行研究:CRISPR関連文献メモ_2016/01/21 Casilio法:dCas9に基づくゲノム・エピゲノム編集と染色体標識;addgene Webサイト"Cheng Lab CRISPR Casilio Plasmids")。
  • 遺伝子発現を抑制する5-メチルシトシン (5mC)の脱メチル化は、TET (Ten-eleven translocation)を介して5mCが、5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC)、5-フォルミルシトシン (5-fC) そして5-カルボキシルシトシン (5-caC)へと酸化され、5-fCと5caCから塩基除去修復 (BER)を経て実現する。Casilio-MEとして、TET1単独 (CasilioME1)、TET1とGADD45A (Casilio-ME2) 、および、TET1とNEIL2 (Casilio-ME3)の3種類を構築し、TET1とDNA修復機構に寄与するタンパク質を同時に送達することで、標的CpGアイランドにおける5mCの脱メチル化と遺伝子発現活性化の亢進を実現した。
  • 他のシステムとの比較 (原論文Fig.1- dから引用)Casilio-ME1
 dCas9-Tet1の利用関連crisp_bio記事

[出典] "Epigenetic editing by CRISPR/dCas9 in Plasmodium falciparum" Xiao B [..] Jiang L. PNAS. 2018-12-24

 CRISPR/Cas9技術によって、相同組み換え効率が低くRNAiが欠損している熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の機能ゲノミクスが進み始めていたが、中国科学院大学 (上海)、上海科技大学、サウスフロリダ大学ならびにNIAIDの研究チームは今回、ヒストンアセチル転移酵素 (HAT)またはヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC)を融合したCRISPR/dCas9によるエピゲノム編集を介して、これまでになく効率的かつ特異的に標的遺伝子発現を調節可能なことを示した。
  • P. falciparumのHAT、PfGAN5、の活性部位を融合したエピジェネティック活性化システムCRISPR/dCas9-GCN5と、P. falciparumのHDAC、PfSir2a、のコーディング領域を融合したエピジェネティック・ノックダウン・システムCRISPR/dCas9-Sir2aを構築。
  • P. falciparumの赤血球侵入に重要な網状赤血球結合タンパク質 (reticulocyte binding protein homolog 4, rh4)と赤血球結合タンパク質 (erythrocyte binding protein 175, eba-175) の転写開始領域のアセチル化と脱アセチル化によって、それぞれ、rh4の活性化とeba-175の抑制を実現。
  • CRISPR/dCas9-Sir2aを利用し、P. falciparum必須遺伝子PfSET1の発現を抑制することで、PfSET1がその標的遺伝子群の発現抑制ひいては栄養体と分裂体においてP. falciparumの成長に与える影響の解析を実現。

Epigenome Editing.
Jeltsch A., Rots M. (eds)
Methods in Molecular Biology, vol 1767.

pp 3-18 Editing the Epigenome: Overview, Open Questions, and Directions of Future Development. Rots MG, Jeltsch A.

pp 19-63 Zinc Fingers, TALEs, and CRISPR Systems: A Comparison of Tools for Epigenome Editing. Waryah C.B, Moses, Arooj M, Blancafort P.

pp 137-146 Allele-Specific Epigenome Editing. Bashtrykov P, Jeltsch A.

pp 167-185 CRISPR/dCas9 Switch Systems for Temporal Transcriptional Control. Gjaltema RAF, Schulz EG.

pp 215-225 Stable Expression of Epigenome Editors via Viral Delivery and Genomic Integration. Kroll C., Rathert P.

pp 227-239 Purified Protein Delivery to Activate an Epigenetically Silenced Allele in Mouse Brain. Pyles B, Bailus BJ, O’Geen H, Segal DJ.

pp 241-254 Non-viral Methodology for Efficient Co-transfection. Kretzmann JA, Evans CW, Norret M, Blancafort P, Swaminathan Iyer K.

pp 419-428 Editing of DNA Methylation Using dCas9-Peptide Repeat and scFv-TET1 Catalytic Domain Fusions. Morita S, Horii T, Hatada I.

pp 429-445 Chemical Inducible dCas9-Guided Editing of H3K27 Acetylation in Mammalian Cells. Gao D, Liang FS.      

pp 447-480 Screening Regulatory Element Function with CRISPR/Cas9-based Epigenome Editing.  Klann TS, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA.

(構造生命科学ニュースウオッチ2016/03/26から転載)
  1. [論説] CRISPR/Cas9は異種間臓器移植を促進するか:Daniel R. Salomon (Scripps)
    • 米国では現時点で120,000人が臓器移植を待ち、年間23,000件の移植が行われる一方で、臓器移植を必要とする患者が毎年50,000人増加する.この厳しい現実のもと、異種移植の研究にドライブがかかっている.
    • ヒトへの臓器移植に最も現実的な動物はブタである.家畜化され、無菌飼育が可能であり、その利用が比較的社会に受容されるからである.
    • 異種移植には、免疫拒絶反応と感染症伝搬のリスクが伴う.免疫拒絶反応の回避については、その分子機構の理解を深める必要がある.感染症リスクについては、Luhang YangとGeorge Churchらはヒトに感染する恐れがあるブタ内在性レトロウイルス(PERVs)60コピーをCRISPR/Cas9によって1ステップで除去し、感染リスクの大幅な抑制を実現した.今後、CRISPR/Cas9システム送達法の改良、遺伝子編集効率の向上およびオフターゲット作用の抑止が必要である. また、免疫拒絶反応の回避と同様に、CRISPR/Cas9技術を活かすには疾病発症の機構の理解を深めることがなによりも重要である.
    • 「バクテリアの免疫機構の因子として発見されたCRISPR/Cas9の応用展開は、極めて基礎的な研究が医学にも大きな転換をもたらす好例である」ことを指摘しておきたい.
  2. [論文] CRISPR/Cas9によるエピゲノム編集:Vlatka Zoldoš (U. Zagreb)
    • エピゲノム編集技術は、DNAメチル化酵素やヒストン脱アセチル化酵素の阻害により非選択的手法から、ZFNs、TALEsあるいはCRISPR/Cas9システムによる特定領域を標的とする手法へ広がってきている。中でも、CRISPR/Cas9による編集が、gRNAsの設計により標的設定とその多重化が容易であり、CpGメチル化に影響されてないことから、特に広がってきている.
    • 研究チームは今回、不活性型Cas9(dCas9)と、DNAメチル化酵素DNMT3Aの触媒ドメインとを、フレキシブルなGly4Serリンカーを介して融合したdCas9-DNMT3Aを開発.
    • BACH2 とIL6ST の2種類の遺伝子座のプロモーター領域内のCpGアイランドのメチル化を高効率かつ高選択性で実現.多重sgRNAを使用することでメチル化レベルが上がり、発現レベルが低下.
    • BACH2 とIL6ST は炎症性腸疾患(IBD)におけるIgGの免疫抑制機能欠損に関与することが示唆されていることから、今回の結果から、CRISPR/Cas9による遺伝子座選択的エピゲノム療法を展開可能と考えられる.
  3. [論文] ゼブラフィッシュ遺伝子機能のクローン解析ツールの開発:Filippo Del Bene (Inst. Curie, PSL Research U.)
    • ゼブラフィッシュにおいてもCRISPR/Cas9による遺伝子ノックアウトはすでに実現しているが、遺伝子破壊を時空間的に制御することは実現していなかった.今回、Tol2 トランスポゾンを用いたGAL4/UASシステムによるCas9 の組織特異的発現による組織特異的遺伝子破壊と、Cre/loxP部位特異的組換えを利用したCas9 発現細胞のラベリングを組見合せた2C-Cas9 (Cre-mediated recombination for Clonal analysis of Cas9 mutant cells)法を開発した.
    • 2C-Cas9法によって網膜前駆細胞のチロシナーゼを標的としたTyr 変異クローンの配列:[KU751772 - KU751776]
  4. [論文] 化学合成crRNA/tracrRNAを使用した変異マウス作出高田修治 (国立成育医療研究センター)
    • CRISPR/Cas9で通常使用されるsgRNAの受精卵へのマイクロインジェクションに替えて、クローニング、シーケンシング、加えて、in vitro 転写と精製も不要な、化学合成crRNA/tracrRNAを、Cas9ニッカーゼ(D10A)またはfCas9(FokI-dCas9)のmRNAとともに受精卵にマイクロインジェクションしてハイスループットでの変異マウス作出が可能に.
    • 変異導入効率とオフターゲット編集の頻度は、Cas9との組みわせにも依存するがほぼ同等.しかし、合成crRNA/tracrRNAは、sgRNAに比べてコストがかかり、RNA量に限界があり、合成に日数がかかる.
  5. [レビュー] CRISPR/Cas9による脳腫瘍モデル動物の作出:Xiao-Yuan MaoZhao-Qian Liu (中南大学); Wei-Lin Jin(上海交通大学)
    • 脳腫瘍動物モデル(CDX, PDX, GEMM)の現状;CRISPR/Cas9(システムの概略);CRISPR/Cas9による脳腫瘍モデリング(標的遺伝子などの提案);課題(送達方法/オフターゲット作用/安全性);将来展望(CRISPR/Cas9による脳腫瘍モデル作出に期待)

出典

1.          [論説] Daniel R. Salomon. "A CRISPR Way to Block PERVs Engineering Organs for Transplantation." N. Engl. J. Med.2016 Mar 17;374(11):1089-91.

2.          [論文] Aleksandar Vojta et al. "Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation." Nucleic Acids Res. Published online 2016 Mar 11.

3.          [論文] Vincenzo Di Donato et al. "2C-Cas9: a versatile tool for clonal analysis of gene function." Genome Res.Published online 2016 Mar 8.

4.          [論文] 寺尾美穂, 玉野萌恵, 原 聡史, 加藤朋子, 木下政人 & 高田修治 "Utilization of the CRISPR/Cas9 system for the efficient production of mutant mice using crRNA/tracrRNA with Cas9 nickase and FokI-dCas9." Exp. Anim.Published online 2016 Mar 14.

5.          [レビュー] Xiao-Yuan Mao et al. "Brain tumor modeling using the CRISPR/Cas9 system: state of the art and view to the future." Oncotarget. 2016 Mar 14. 

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