タグ:クライオ電顕

[出典] Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Ho CM, Li X [..] Zhou H. Nat Methods. 2019-11-25.
 タンパク質のX線結晶構造解析にあたっては、解析可能な結晶サンプルを調整するために、しばしばタンパク質への変異導入やアミノ酸鎖の短縮といった前処理が必要であったが、近年、タンパク質の結晶化を必要としないクライオ電顕 (cryoEM)法による構造再構成法に'resolution revolusion'が起こり [1-3]、立体構造解析を阻んでいたタンパク質の近原子分解能 (3.0–4.0 Å)のマップが次々に明らかにされるに至った。
  • UCLAを主とする研究グループは今回、ab initio cryoEMマップからタンパク質を同定するプログラムcryoIDを開発し、前処理をすることなく内在細胞環境から直接濃縮した未同定のタンパク質複合体の近原子分解能のab initio cryoEMマップに、質量分析に基づくボトムアップ・プロテオミクスを組み合わせることで、複合体を構成するタンパク質の同定を実現し、これを、ボトムアップ内在構造プロテオミクス (a bottom-up endogenous structural proteomics: 以下、BESP)と称した。
  • 具体的には、これまでの構造生物学の手法が通用しなかった熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumイタの細胞溶解液を対象とするBESPから、赤血球内生存に関与する多タンパク質複合体の原子モデル構築を実現した。
[参考crisp_bio記事例]

[出典] "Structural basis for AcrVA4 inhibition of specific CRISPR-Cas12a" Knott GJ [..] Doudna JA. eLife. 2019-08-09.

 先行研究でCas12aを阻害する3種類のタンパク質Acr-VA1, -VA4および-VA5を発見したJ. A. Doudnaらは、その後、生化学的実験や ネガティブ染色電子顕微鏡法によって、Cas12aを阻害する分子機構を解き明かしてきたが、今回、クライオ電顕単粒子再構成法によってAcrVA4がLbCas12aを阻害する構造基盤を明らかにした:
 ・EMDB-20266  (PDB-6P7M) LbCas12a-crRNA: AcrVA4 (1:2 complex) (分解能 2.99 Å)
 ・EMDB-20267 (PDB-6P7N) LbCas12a-crRNA: AcrVA4 (2:2 complex) (分解能 4.91 Å)
 ・[crisp_bio注] 全体構造について原論文Figure 1引用下図左参照
Overall structure AcrVA4
  • AcrVA4は、CRISPRアレイから転写されたpre-crRNAを切断し成熟crRNAを生成するCas12aのヌクレアーゼ、ならびに、成熟crRNAの5'末端に、直接結合することで (原論文Figure 2引用上図右参照)、LbCas12aのdsDNAへの結合をアロステリックに阻害する。
  • AcrVA4は二量体を形成するが、二量体化がCas12a阻害活性に必須あるいは阻害活性を亢進することはないことを確認した。
  • また、Acidaminococcus sp. Cas12a (AsCas12a)はその独特のヘリックスバンドルによってAcrVA4の結合を阻害することも見出した。
  • 研究グループは、Cas12aとAcrとの共進化についても論じた (原論文Figure 7引用下図参照)co-evolution
 AcrVA4関連crisp_bio記事

[出典]
"Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR-Cas system" Halpin-Healy T, Klompe S, Sternberg S, Fernández I. bioRxiv 2019-07-18. > Nature. 2019-12-18
構造情報:
 EMDB - 20349, 20350, 20351
 6PIF VC-Tn6677 multisubunit CRISPR/Cas effector, close conformation (3.4 Å)
 6PIG VC-Tn6677 multisubunit CRISPR/Cas effector, open conformation (3.5 Å)
 6PIJ VC-Tn6677 multisubunit CRISPR/Cas effector, close conformation (2.9 Å) 

背景
  • タイプI CRISPR-CasシステムのエフェクターCascade複合体は、ヘリカーゼかつヌクレアーゼであるCas3と協働して外来DNAを分解する。一方で、Cas3を欠損している宿主細胞では、バクテリアTn7様トランスポゾンと協働して、DNA断片の転移を誘導する。
  • コロンビア大学のS. H. Sternbergの研究チームは、Cascadeを帯びたVibrio choleraeトランスポゾンTn6677を利用して、二本鎖DNA切断を介すことなく、大腸菌ゲノムへのドナーDNAのノックインを実現していた [*1]。
  • 同チームは今回 (Nature NEWS & VIEWScrisp_bio記事 [2*])、同大学の構造生物学者Israel S. Fernándezと共同で、その構造基盤をクライオ電顕単粒子再構成法により解明し、bioRxivに投稿した。
構造
  • Sternbergチームは先行研究 [*1]にて、V. choleraeトランスポゾンTn6677の遺伝子構造モデルとして、L-//- tniQ - cas8/5 -cas7 - cas6 - CRISPR array - //- tnsC - tnsB - tnsA - R (tniQtnsDのホモログ;LとRは反復配列)を提案していた。
  • Sternbergチームは今回、ヘッドトゥーテールで二量体を形成したTniQがCascadeの中のcrRNAの3'末端近位に位置するCas6とCas7に結合し、一方で、Cascadeの中のCas8/5融合タンパク質が5' crRNAのハンドルに結合しフレキシブルな挿入ドメインを介してTniQに接し、TniQ-Cascadeの複合体を形成する構造モデルを提案した (筆頭著者のTweetからの引用した下図参照)。
  • さらに、標的DNAが結合したクライオ電顕再構成構造から、PAMの認識とR-ループ形成を担う相互作用のモデルも提案した。

[出典] "Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9" Zhu X, Clarke R, Puppala AK [...] Merrill  BJ, Simonović  M, Subramaniam  S. Nat Struct Mol Biol 2019-07-08;[NEWS & VIEWS] "The final cut: Cas9 editing" Taylor DW. Nat Struct Mol Biol 2019-07-08.

 SpCas9の構造については、標的DNAが結合していない不活性な構造、dsDNAが入り込むチャネルが形成されたCas9の構造、およびSpCas9・sgRNA・標的DNA鎖の三者複合体構造が、X線結晶構造解析そしてまたはクライオ電顕法で明らかにされてきたところ、今回、 National Cancer Institute、University of Illinois at Chicago、University of British Columbiaなどの研究グループが、クライオ電顕法により、Mgイオン存在下でCas9がdsDNAを切断するにあたり、HNHとREC2およびREC3とRuVが協調して機能する3種類の状態(State I /pre-catalytic, State II /post-catalytic およびState III/product)を捉え、Cas9の高精度化に有用な情報を提供するに至った:
  • State I (3.3 Å 分解能 EMD0585/PDB6O0Z): crRNA・tracrRNAの結合によって形成されたチャネルにdsDNAのうちcrRNAの標的鎖が入り込みながら、HNHドメインは標的鎖から ~30 Å離れて位置しREC2ドメインが標的鎖への接近を阻害し、切断が妥当かをチェックする'chekpoint'の状態 
  • State II (3.37 Å 分解能 EMD0584/PDB 6O0Y): State Iから、REC2ドメインが標的鎖から離れ、HNHドメインが劇的に~34-Å スイングし触媒部位で標的鎖を切断しながらも、標的鎖に結合し、RuVCが非標的鎖を切断し保持している状態
  • State III (3.28 Å 分解能  EMD0583/PDB 6O0X)): HNHドメインが標的鎖から離れ、REC2も移動して、'checkpoint’での位置に戻り、REC3とREC2が標的鎖を保持し、RuvCドメインが非標的鎖を保持し、Cas9から切断されたDNAが遊離する直前の状態
 参考図

出典 
  • [NEWS&VIEWS] "Lipopolysaccharide transport ratcheted up" Bishop RE. Nature. 2019-03-20
  • [Li 論文] "Structural basis of lipopolysaccharide extraction by the LptB2FGC complex" Li Y,  Orlando BJ,  liao M. Nature. 2019-03-20
  • [Owen 論文] "Structural basis of unidirectional export of lipopolysaccharide to the cell surface" Owens TW [..]  Bertani BR, Ruiz N, Kruse AC. Nature. 2019-03-20.
  • [crisp_bio注] 構造情報は文末参照
背景
  • グラム陰性菌の表層は、リン脂質の二重層からなる細胞質膜 (細胞内膜)と、その外側にペリプラズムと呼ばれる薄い空間を介して、内側がリン脂質、外側がリポ多糖 (LPS: Lipopolysaccharide)で構成される非対称な脂質二重層 (細胞外膜)とで形作られている*。
  • LPSは細胞質で生成され、細胞内膜のペリプラズム側から引き出され、ペリプラズムを横断して細胞外膜へと輸送され、細胞外膜の細胞外側に位置するに至る。この輸送装置の実体は、LptAからLptGと呼ばれる7種類のリポ多糖輸送タンパク質 (Lpt: Lipopolysaccharide transport proteins)であることが知られている (下図* 参照)。Lpts 2019-03-23
  • (*) 奥田 傑・Daniel Kahne「大腸菌のペリプラズム空間でのリポ多糖の輸送は細胞質におけるATP加水分解エネルギーにより駆動される」ライフサイエンス新着論文レビュー 2012年12月4日 © 2012 奥田 傑・Daniel Kahne Licensed under CC 表示 2.1 日本
成果
  • 細胞内膜の細胞質側で生成されたLPS前駆体は、ABC輸送体フリッパーゼのMsbAによって細胞内膜を横断して成熟型になり、第2のABC輸送体であるLptB2FGC複合体によって細胞内膜から引き出され、LptC, LptAおよびLptD-LptEで形作られるブリッジを経て細胞外膜の細胞外表面側へと到達する。
  • このLptB2FGC複合体の構造が今回、Li (Harvard Medical School)ら、ならびに、Owen (Harvard University)らによって、それぞれ、Escherichia coliについてクライオ電顕法で、Vibrio choleraeEnterobacter cloacaeについてX線結晶構造解析により解かれ、その結果、LptB2FGC複合体がLPSに結合し、それに伴いLptB2FGC複合体のコンフォメーションが変化し、LPSが非可逆的に細胞外膜へ輸送される過程の分子機序が詳らかにされた。
機序
  • LptCの膜貫通ヘリックスが、LptFとLptGの間に"クサビ"として入り込み、キャビティーが生成されて、LPSが先行研究で見出されていたLptB2FGC複合体内チャンバーへと移動し、 βゼリーロール構造として知られるLptF内のLPS結合モチーフに局在し、LptC, LptAおよびLptDのβゼリーロール構造を経て細胞外膜表面に至る。先行研究では、LptFとLptGが対称関係にありいずれもがLPSの輸送経路になるとされていた。今回、"クサビ"が非対称的に入ることでLptFとLptGの関係も非対称になり、LptCの βゼリーロール構造ドメインがLptFに選択的に重なる。こうして、LptFからLptDまでLPSの輸送経路となるβゼリーロール構造が連続し、LptGを経由した輸送は発生しない。
  • ATPの加水分解とLPSの共役関係が、LptCと結合している状態のLptB2FGC複合体でより強くなることも同定された。ATPのLptB2FGC複合体への結合と加水分解のサイクルと、1分子のLPSがLptB2FGC複合体チャンバーからLptCひいてはブリッジへの押し出される事象とが、共役する。OwenらはV. choleraeE. LptB2FGC複合体の構造比較と変異誘導実験からブリッジの入り口にゲート構造が存在し、ATPの加水分解には影響することなく、その開閉によってブラウン運動によるLPSの細胞内膜への逆行が防止されることを示唆した。
構造情報 Li 論文
  • EMD-9118 nucleotide-free LptB2FG (4Å分解能)
  • EMD-9125 nucleotide-free LptB2FGC, final map (4.2Å分解能)
  • EMD-9128 nucleotide-free LptB2FGC, map with clear LPS density (4.4Å分解能)
  • EMD-9130 nucleotide-free LptB2FG, βJRshort map (5.9Å分解能)
  • EMD-9129 nucleotide-free LptB2FGC, βJRlong map (4.8Å分解能) 
  • EMD-9124  vanadate-trapped LptB2FG (4.1Å分解能)
  • EMD-9126  vanadate-trapped LptB2FGC (4.3Å分解能)
  • 6MHU nucleotide-free LptB2FG
  • 6MI7  nucleotide-free LptB2FGC
  • 6MHZ  vanadate-trapped LptB2FG
  • 6MI8  vanadate-trapped LptB2FGC
構造情報 Owen論文
  • 6MIT  LptB2FGC from Enterobacter cloacae (3.2 Å分解能)
  • 6MJP LptB(E163Q)FGC from Vibrio cholerae (2.85 Å 分解能)

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