タグ:タンパク質工学

[出典] "5 questions about LOCKR from our Reddit AMA" Institute for Protein Design (IPD) 2019-08-05.

 RedditのAMA "Ask Me Anything about LOCKR"に参加したBobby Langan (UW), Andrew Ng (UCSF)ならびにHana El-Samad (UCSF)が、時間切れになるまで続いた質問の中から5人の質問を選びIPDのWebサイトにて公開した。
[Q1] LOCKRという'クール'な命名はどこから? 偶然ですか?
 Scott E. Boyken (UW)と1週間ほどあれこれ試し、彼がLOCKを思いつき、私 (Bobby Langan)が、最近のトレンド (CRISPR, tumblr, flickr, grindrなど)もありpRoteinのRを加えてLOCKRになりました。

[Q2]  発想はどこから? LOCKRは副作用を伴うのか? 例示された外傷性脳損傷の急性炎症への適用の他に、自己免疫疾患に見られる慢性炎症にも適用可能か?
[Q3] 商品化の予定は?
  • 商品化に向けた研究は始まっていますが、ヒト疾患に適用可能になるまでには、他の創薬と同様に長い年月 (many years)がかかります。
[Q4] オフターゲット結合のリスクは? LOCKRをオンにする"key"タンパク質は内在性である必要があるのか、医薬品でオンにすることは可能か?
  • 細胞は、すべてが渾然一体となったブリートのようなものなので、オフターゲット相互作用のリスクは常に内在していますが、完全な人工物であるLOCKRは、天然に存在するタンパク質を改変した人工タンパク質よりもそのリスクは小さいと想定します。
  • 現行LOCKRの"key"は、設計した人工タンパク質ですが、内在タンパク質や外因性低分子を"key"とするLOCKRの開発に関心が集まっています。
[Q5] いつか世界を変えたいと思っている学部生へのアドバイスは? 人工膝関節置換手術後の腫れや慢性炎症の予防や治療に使えるか? 臓器移植後の免疫抑制に使えるか?
  • 世界を変えるパッションを持ち続けよ、理工学 (science and engineering)を追い求めよ、積極的に研究に取り組め。
  • 人工膝関節置換手術にしても臓器移植にしても、細胞療法 (細胞を取り出し、LOCKRを埋め込み、戻す)を介して十分適用可能と信じています。細胞療法が安定した効用を安全に発揮するために、細胞が"smart"である必要があります (細胞内の微小環境を検知し応答する機能を備えている必要があります)。この課題こそ、LOCKRとその他の合成タンパク質および合成生物学の出番です
  • ところで、LOCKRを組み込んだ細胞は、"仕事が終われば"自ら失活することから、ゲノム改変とは異なり、むしろ、"smart pill"に相当します。

[NEWS RELEASE] "Designed switch allows unprecedented control over cells" UW Medicine Newsroom 2019-07-24.  [YouTube: 2m51s] Controlling cell functions with a designed switch 
  • David Baker (UW Medicine Institute for Protein Design、以下UW)とHana El-Samad (UCSF)が率いるバイオエンジニアリング・グループは、生細胞内の複雑な遺伝子回路を調節あるいは乗っ取る (commandeer)ことも可能とする長さ8 nmの自己組織化するタンパク質スイッチ'Latching, Orthogonal Cage/Key pRotein (LOCKR)'を開発し、その設計と応用をNatureにて姉妹論文として発表した。LOCKRは完全な人工物であることから、光遺伝学やCRISPRといった最新技術を含むこれまでのバイオテクノロジーと一線を画している。
  • 研究グループはLOCKRによる、遺伝子発現調節、細胞内輸送の方向変更、特定タンパク質分解、および、タンパク質間相互作用の制御を、酵母およびヒト細胞において、実証した。さらに、LOCKRにより、自律センサとして機能する一連の新規な生物学的回路を合成した。これらの回路は、細胞内または細胞の外部環境からのキューを検知し、しかるべき細胞応答を起動し、しかるべく終了させる。
  • LOCKRはInstiture for Protein Designのツイートから引用した下図にあるように、活性部位から遠い部位への分子結合に伴うコンフォメーションの変化 (アロステリック作用)や、結合時に活性部位のコンフォメーションを変化させる誘導適合 (indced fitting) と同等の効果を、全く異なる機構で実現している。
  • LOCKRは、5重のヘリックスからなる安定なCAGEの同一面への、分子内相互作用によるLATCHペプチドの結合と、分子間相互作用によるKEYペプチドの結合の間の競合に基づいて作動する。OFFの状態では、生理活性ペプチドを帯びているLATCHがCAGEに留められており、ONの状態では、KEYによってLATCHがCAGEから外れることでLATCH上の生理活性ペプチドがCAGEの外部に露出し、生理活性を発揮する。生理活性ペプチドには、標的分子への結合、標的タンパク質分解、核移行シグナルなどの機能を持たせることができる。
  • アロステリック作用の機構をデノボで再現するには、ペプチド鎖が構造をとっていない状態に対して自由エネルギーが十分に低い構造をとり、かつ、不活性状態と活性状態さらにはその中間状態の間での自由エネルギーの差を互いに遷移可能な程度に十分小さくするという、極めて困難なタンパク質設計に取り組む必要があったところ、LOCKRによって、アロステリック機構と同等の機能を実現した。
Nature姉妹論文
  1. 設計論文 "De novo design of bioactive protein switches" Langan RA, Boyken SE, Ng AH [..]  Baker D. Nature. 2019 Jul 24.
  2. 応用論文 "Modular and tunable biological feedback control using a de novo protein switch"  Ng AH [..] El-Samad H. Nature. 2019 Jul 24.

[出典] NEWS AND VIEWS "An ‘on’ switch for proteins" Hahn KM. Nature 2019-05-08.; 論文 "Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems" Wang J, Liu Y, Liu Y [..] Wang C, Chen PR. Nature 2019-05-08.

ケージ化
  • 生理活性を帯びた分子を、光で迅速分解可能な保護基で保護することで不活性状態にとどめ (ケージに入れ)、光照射により活性化する (ケージから出す)技術は、光によるペプチドやタンパク質の活性制御にも応用され、筋収縮、細胞内シグナル伝達、神経伝達などの解析に貢献してきた (Pharmacol Ther, 2001)。
  • 北京大学の研究グループは今回、ケージ化可能なタンパク質を一気に広げるケージ化法を開発し、CAGE-prox (computationally aided and genetically encoded proximal decaging)と命名した。
CAGE-prox
  • 研究グループはタンパク質と基質の結合を保護基により物理的に阻害するために、タンパク質の安定性と基質の結合を体系的に解析した上で、Rosettaにより、解析対象とするタンパク質(protein of interest: POI)の中で、保護基が結合すると基質への結合が阻害される機能部位に近接したアミノ酸の位置を同定するコンピュータプログラムを開発した。
  • コンピュタープログラムで同定した位置のアミノ酸を、ケージに入れたチロシン残基 (photocaged o‐nitrobenzyl‐O‐tyrosine: ONBY)に置換することで、光照射によって、瞬時にチロシン残基をケージから出し、POIと基質の結合を実現する (原論文 Fig. 1参照)。
CAGE-proxの特長
  • CAGE-proxでは、従来の手法と異なり活性部位の鍵となるアミノ酸残基をケージに入れる必要がなく、CAGE-proxで使用するケージ化位置同定コンピュータプログラムも、POIの活性部位や作用機構の情報を必要としない。
  • 加えて、置換アミノ酸としてチロシンを選択してPOI本来のコンフォメーションと活性に対する影響を最小限に留め、標的位置のアミノ酸によらず常にONBYで修飾したチロシンで置換する。こうして、CAGE-proxは、in vivoで光活性化可能なPOIを一気に広げることになった。
CAGE-proxの効果
  • CAGE-proxの開発モデルタンパク質:ホタルルシフェラーゼ (Fluc)
  • POIの光活性化の実証:KRAS、RNAデメチラーゼ (FTO)、NanoLuc、MEK1キナーゼ、カスパーゼ3および炭疽菌致死因子(LF)
  • GACE-proxを利用した細胞プロセス解析例:内在MEK1の活性を阻害剤で阻害し、阻害剤耐性を帯びたMEK1-ONBYを介して、内在パスウエイと直交するパスウエイを解析;アポトーシスの初期段階におけるカスパーゼ3による基質分解プロファイリング;A375メラノーマ細胞移植モデルマウスにおける不活性で細胞障害性が抑制されたLF-ONBYからのLF光活性化による腫瘍抑制 (LF-ONBYのプロドラッグとしての利用)

 [出典] "VEGAS as a Platform for Facile Directed Evolution in Mammalian Cells" English JG [..] Roth BL. Cell 2019 -07-04;[NEWS] "Scientists Invent Fast Method for ‘Directed Evolution’ of Molecules" UNC Health Care and UNC School of Medicine 2019-07-04

背景
  • 2018年ノーベル化学賞に対象となった指向性進化法 (Directed Evolution: DE)は、自然界の進化に倣ってDNAの突然変異誘発による多様化と選択のサイクルを繰り返すことで、自然界にはみられない高性能な抗体、酵素、蛍光レポータとして機能する変異タンパク質の作出を可能とした (参考資料[1], [2])。 
  • これまでのDEは主としてファージ、大腸菌、酵母などをプラットフォームとして、「特定の遺伝子にランダム突然変異を誘発し、変異DNAライブラリから発現させた (display)ペプチド群から、目的とする特性を帯びたペプチド (ヒット)をスクリーンし、続いて、ヒットに対応する変異DNAに再びランダム突然変異を誘発」というラウンドを繰り返していく。
  • しかし、非哺乳類細胞をプラットフォームとして得たタンパク質は、必ずしも、ヒト細胞で目的とする特性を発揮せず、また、哺乳類細胞をプラットフォームとするDEも開発されてきたが、時間、コスト、そして、目的に特化したスクリーンシステムの開発を必要としていた。
VEGAS
  • University of North Carolinaの研究グループは今回、指向性進化の標的遺伝子を、哺乳類細胞への遺伝子導入効率、遺伝子発現効率、および突然変異率が高く、宿主細胞再感染に十分な力価で自律的に複製し、安全性も高いトガウイルス科アルファウイルス属のssRNAウイルスの一種であるシンドビスウイルス (Sindbis virus: SINV)に標的遺伝子を導入することで、ヒト細胞株をプラットフォームとする簡便で多用途なDEを確立し、VEGAS (Viral Evolution of Genetically Actuating Sequences)と称した。 
  • VEGASは、多くのin vitroシステムに優る1ラウンドあたり10-3の突然変異率と1ラウンドあたり1日の効率を達成し、ヒットのリセットやリサイクルが不要である。
VEGAS実証実験
  • 22種類の変異を導入し高濃度のドキシサイクリン存在下でも活性なテトラサイクリン調節性トランス活性化因子 (tetracycline transactivator: tTA)を7日間で、これまで殆ど解析されて来なかったGPCRの一種である霊長類に特異的なMRGPRX2の常時活性化変異体を3日間で、および、3種類のGPCR (セロトニン受容体、ドーパミン受容体および pH感知受容体)をアロステリックに活性化するナノボディーを1週間で、実現した。また、実証実験の過程で、活性化の鍵となる領域の同定も実現した。
  • [注] モデルとして使用した細胞株:HEK293T; HEK-P; HEK-Gαq/11/sΔ; HTLA; ハムスターBHK21
応用展開
  • SINVのパッケージング容量は6 kbを超えることから、高精度なCas9変異体、高性能な蛍光タンパク質変異体、合成された特定の薬剤によってのみ活性化される合成受容体 (designer receptors exclusively activated by designer drugs: DREADDs)の開発など、広範なタンパク質の人工進化に展開可能である。
参考資料

[出典] "De novo design of tunable, pH-driven conformational changes" Boyken SE [..] Baker D. Science 2019-05-17
  • 目的とする構造と機能を帯びたタンパク質をデノボ設計する技術は、アミノ酸と折り畳み構造が成す大空間を探索する手法の進歩とエネルギー関数の改良によって、自由エネルギーの底にある安定なタンパク質を設計・合成できるところにまで到達した。
  • David Bakerが率いるUW、Ohio State University、LBNL、HHMI Janeliaの研究グループは今回、これまで実現していなかった環境変化に応答してコンフォメーションを変えるタンパク質の合成に成功した。すなわち、ヒスチジン (His)を水素結合ネットワークに埋め込むことで、pHに応答して自己組織化(重合)と単量体へとコンフォメションを変えるタンパク質 (pH-responsive oligomers, pROs)を設計・合成した。
  • Hisは中性pHでは電荷を帯びず、pH低下(酸性化)で正電荷を帯びる特徴を有し、酵素の活性中心に見られ、タンパク質の高次構造の維持に寄与することが知られている。研究グループはこのHisの特徴を活かして、ヘリックスバンドルとそらを束ねるHisネットワーク (以下、His-net)からなり、pH6.5以上では安定な構造のホモ三量体とヘテロ二量体へと自己組織化し、pH低下に応じたHis-netのプロトン化に伴って、水素結合ネットワークが壊れ、内部に静電反発力と立体斥力が蓄積され、単量体化するpROsを設計・合成した。
  • pROsはin vitroにてpH依存でリポーソームを破壊した。また、U2-OS細胞において、pROsがエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれてリソソーム膜に輸送され・局在し、リソソームからのプロトン・リーケージを誘導してリソソームのpHを上昇させ、リソソーム・プロテアーゼによる分解を免れることを見出した (His-netを帯びていないヘリックスバンドル二量体・三量体はリソソームで分解された)。
  • pROsのpHの変化に応じたコンフォメーション変化は、His-netの数と疎水性相互作用の強さで調節可能である (原論文 Fi.g 3参照: m(赤)-His-netの層; n (黒) 疎水性相互作用の層;l (青) ヒスチジンを含まない極性ネットワークの層)の重ね方で調節可能である。
  • pHの変化に応じてエンドサイトーシス経路を介して細胞質へと浸透可能なpROsは薬物送達担体として、細胞毒性のリスクを伴う細胞透過性リポソームや、宿主細胞の免疫応答のリスクを伴うウイルスベクターに優る特性を帯びている。
  • 構造情報:6MSQ (pro-2.3);6MSR (pRO-2.5: PDB引用下図参照)2019-05-20

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