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[出典] Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Levy JM [..] Liu DR. Nat Biomed Eng. 2020-01-14
  • 1塩基置換法であるCBEとABEは、そのサイズの問題から、遺伝子治療に広く利用されているAAVによるデリバリーが困難であった。CBEとABEそれに続くPE[*]を開発してきたDavide R. Liuの研究グループは今回、表題の手法を実現した (* 2019-10-22 David R. Liuグループからプライムなゲノム編集法 - BEsに続くPEs) 。
  • 2分割し、デュアルAAVsでデリバリーされたCBEまたはABEは、予め組み込んであったインテインを介して自動的に再構成され、脳、肝臓、網膜、心臓および骨格筋にて、しかるべき一塩基置換を実現した。効率はそれぞれ、59%、38%、38%、20%、および9%に達した。
  • また、運動失調などを呈する神経変性症の一種であるニーマン・ピック病C型の責任変異を修復し、その結果、神経変性の進行が遅れ寿命が伸びることを確認した。

[crisp_bio注] 2020-01-09 17:30 新生仔マウスに関する論文[*]の書誌情報とリンクを補足

[出典1] Long-Term AAV-Mediated Factor VIII Expression in Nine Hemophilia A Dogs: A 10 Year Follow-up Analysis on Durability, Safety and Vector Integration. Nguyen GN [..] Sabatino DE. Blood. 2019-11-13; 134 (Supplement 1). 61st Annual Meeting and Exposition (December 7-10, 2019)
[出典2] Virus used in gene therapies may pose cancer risk, dog study hints. Kaiser J. Science. 2020-01-06 8:00 AM

 アデノ随伴ウイルス (AAV)は、ヒトに対して安全でありかつ長期間の発現を可能とすることから、遺伝子導入ベクターとしてひろく利用され、また、改良が続けられている。新生仔マウスへの高用量AAV投与が、カーゴの遺伝子の宿主ゲノムへのインテグレーションと肝細胞癌を誘発することが報告 [*]されたが、遺伝子治療の専門家の多くは、新生仔マウスでの結果はヒト成人には外挿されないという見解をとってきた。
[*] AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Donsante A1, Miller DG, Li Y, Vogler C, Brunt EM, Russell DW, Sands MS. Science. 2007 Jul 27;317(5837):477

 2019年の米国血液学会にて、University of Pennsylvaniaを中心とした研究グループが、血友病モデル犬に血液凝固第Ⅷ因子 (FVIII)遺伝子をAAVでデリバリーし10年間観察した結果に基づいて、遺伝子または調節因子配列の断片の宿主ゲノムへのインテグレーションが決して稀な現象ではないことを報告した。 同時に、その間に、新生仔マウスの事例と異なり、肝臓に腫瘍発生などの異常は発生しなかったことも報告した [出典1参照]。
  • AAV-canine FVIII (cFVIII)を9頭のHAモデル犬にデリバリーし、10年にわたりFVIIIの発現が維持されることを確認した。
  • デリバリーは2種類の手法を試した:cFVIIIの重鎖と軽鎖をそれぞれのAAVでデリバリー (サイロキシン結合グロブリン・プロモーターを使用);一本鎖のcFVIIIを一つのAAVでデリバリー (ヒトalpha-1 anti-trypsinプロモーターを使用)
  • いずれの手法も、細胞毒性を伴わず、突発性出血を95%以上低減した。
  • cFVIIIの発現レベルは、9頭のうち7頭では一定していた。残る2頭ではcFVIIIデリバリー後、〜3年経過した頃から上昇し、その後も4年または7年間、上昇が続いたが、肝機能に異常は見られず、腫瘍も発生しなかった。
  • 6頭の肝臓由来の18検体を分析し、ゲノムワイドでインテグレーション (44〜413件)が発生し、ベクターのコピー数とインテグレーション件数が相関し、細胞成長関連遺伝子近傍へのインテグレーションとクローン増殖が相関することを、見出した。
  • インテグレーションとクローン増殖が見られた一方で、腫瘍の発生は見られず、また、2頭に見られたcFVIIIの発現レベル上昇がクローン増殖と相関するかについては不明であった。
 Scienceのブログ [出典2参照]によると、今回の報告に対する研究者の反応は、インテグレーションの頻度は比較的低く、cFVIIIが奏功し、いずれにしても、エピソームとして存在するcFVIIIは細胞分裂ごとに低減していという楽観的な反応と、より長期の観察や他の臓器についての検証が必要とする反応に、分かれた。また、FDAは現在、AAVを介した遺伝子治療を受けた患者は、5年以上のフォローアップ期間、肝臓癌の兆候をモニタすることを義務付けている。


[出典] Plasmid-based and -free methods using CRISPR/Cas9 system for replacement of targeted genes in Colletotrichum sansevieriae. Nakamura M, Okamura Y, Iwai H. Sci Rep. 2019-12-12

 鹿児島大学の研究グループは今回、組換え頻度が低い植物病原菌類C. sansevieriaeにおいて、メラニン生合成の有無により編集結果を容易に判定できるシタロン脱水酵素 (SCD1)遺伝子をモデルとして、プロトプラストへのCas9, sgRNAおよびドナーDNAのデリバー法の置換効率を比較評価した:
  • 従来のプロトプラスト-PEG法での効率は 0-1.4%
  • ドナーDNAとCas-sgRNAをそれぞれプラスミドでデリバリーの効率 97.1% (67/69);相同アームの長さを50/500/1,000/1,500 bpと変えた結果、長いほど相同組み換え効率が高くなる傾向
  • Cas9とドナーDNA-sgRNAをそれぞれプラミドでデリバリーの効率 94.7% (91/96)
  • Cas9タンパク質とsgRNAのRNPをデリバリーの効率 82.1% (23/28)
  • Casタンパク質とドナーDNA-sgRNAの発現プラスミドをデリバリー (以下、ハイブリッド) の効率89.2% (23/28);SCD1以外の遺伝子4種類についても遺伝子置換を実現
 研究グループは、Colletotrichum spp.に限らず、多様な生物種の遺伝子置換に、利便性や経済性の観点から、ハイブリッドシステムが向いているとした。

[出典] Ex/in vivo gene editing in hepatocytes using “all-in-one” CRISPR-AAV vectors with a self-linearizing repair template. Krooss S, Dai Z [..] Ott M. iScience. 2019-12-12

 Hannover Medical Schoolを主とする研究グループは今回、サイズ5.73 kbのSLテンプレートを組み込んだカーゴ "SaCas9-gRNA1-SL (self-linearization)修復テンプレート-gRNA2" (以下、AIO-SL)を、カプシドタンパク質のVP2を欠損させたAAV2または向肝性AAV8により、ex vivoまたはin vivoでマウスへデリバリーした。
  • SaCas9が誘導するHDRを介したチロシン血症モデルマウスにおけるフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ(FAH)遺伝子の第5エクソンの修復を目指した。
  • Fahを欠損させたiHep細胞 (induced hepatocyte-like cells)にAIO-SLをAAV2でデリバリーした細胞を移植するex vivoの手法と、AIO-SLをAAV8にて尾静脈注射を介して直接マウスにデイバリーするin vivoの手法の双方について、マウスにおいて、正常なFAHを発現する肝細胞の増加と長寿化が実現することを確認した。
  • SLテンプレートを利用することで効率は~6倍になり、VP2の欠損はAAV8のカーゴの上限を6.17 kbにまで拡張することも見出した。

[出典] Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Ogden PJ, Kelsic ED, Sinai S, Church GM. Science. 2019-11-29

概要
 Dyno Therapeuticsの共同設立者を含むHarvard Medical School/Wyss Institute for Biomedically Inspired Engineeringの研究グループは、AAV2のカプシドの全てのコドンの変異体ライブラリーを構築し、各変異とウイルスの特性の相関データを蓄積し、そのデータ分析に基づく設計により、マウス肝臓への選択的遺伝子導入性を高めたAAV2カプシド複合変異体を作出するに至った。

詳細
  • アデノ随伴ウイルス (AAV)カプシドの中でも最もよく利用されているAAV2カプシドの735アミノ酸 (コドン)すべてについて、同義置換を含む置換および単一コドンの挿入と削除を誘導し、プロモーター/ITR/全長カプシド/ITR/バーコードからなるプール型ライブラリーを構築した。
  • ~200,000変異体全てについて、ウイルス産生 (カプシド集合とゲノムパッケージング)、A20中和抗体逃避能、および熱安定性をin vitroでアッセイし、野生型を対照とする変異体の適応度ランドスケープを明らかにした。
  • In vitroアッセイの過程で、変異体の表現形質に影響を及ぼす変異コドンの位置や変異の種類の傾向を分析するとともに、研究グループは、フレームシフトに拠って生成されるORFsの中から、野生型のタンパク質を競合排除する形で、フィットネスを損なうことなくタンパク質として発現するORFを同定した。
  • 具体的には、アッセンブリ活性化タンパク質 (Assembly Activating Protein, AAP)において、フレームシフトに拠って生成されるORFsのフィットネスに基づいて、CTGを開始コドンとする119アミノ酸のORFに注目した。この配列に相同なタンパク質はNCBIの非冗長タンパク質データベースからは見出せなかったが、HEK293T細胞において、タンパク質発現を同定した。このタンパク質は、興味深いことに、AAV2が核小体で集合するのに対して、細胞膜に局在していたことから、研究グループはこれを“membrane-associated accessory protein” (MAAP)と命名した。
  • 遺伝子治療への利用にあたって重要な表現形質である生体内分布については、マウスに変異体ベクターを後眼窩静脈叢注入後18日後に、脾臓、肝臓、腎臓、心臓、および肺への分布をアッセイすることで、データを収集し、主成分分析とクラスター分析を経て、各組織への向性とカプシドの構造 (変異コドンの位置)との相関関係を明らかにした。
  • ここで研究グループは、肝臓への向性をもたらす変異のデータをもとに、フィットネスを損なうことなく、肝臓への向性を相加的に高める複合変異の可能性を探るために、カプシドを構成するアミノ酸の561から588までの領域に1~10ヶ所の変異を導入する実験を行った。その結果、1,271変異体を設計・作出し、ランダムに生成した10,047変異体とその向性とフィットネスを比較し、今回の設計が、効率よく、よりフィットネスが高く、肝臓へのより強い向性を示すカプシドをもたらすこが、示された。
  • 以上、カプシド全変異体ライブラリーのデータに基づく変異体の設計は、カプシド構造に基づく合理的設計やランダム突然変異に基づく指向性進化法では得られない有用な変異体の効率的作出を可能とする。
  • [AAV関連crisp_bio記事] 2019-08-27 T4カプシドをAAVが導くハイブリッドウイルスベクターを開発し、DNAとタンパク質の大量・多重デリバリーを実現

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