タグ:プロテオゲノミクス

[出典] Microscaled proteogenomic methods for precision oncology. Satpathy S [..] Carr SA, Ellis MJ. Nat Commun 2020-01-27. (bioRxiv. 2019-10-09)

 癌のプロテオゲノミクス[*]は、癌のゲノミクスならびにトランスクリプトミクスのデータにプロテオミクスのデータを加えて統合解析する手法であり、癌の生物学と治療標的を深く理解する (deep insights)手がかりを供する [* WikipediaのProteogenomicsの項 から引用した下図概念図参照; Nat Methods 2014]Proteogenomics
 Broad Institute、Baylor College of Medicine、Siteman Comprehensive Cancer Center (WUSTL)などの研究グループは今回、これまでの手法に比べて、極めて少量のサンプルの採取法にサンプル中に微量に存在するタンパク質 (deep proteome)の検出も検出可能なプロテオミクス技術を組合わせることで、トランスレーショナル研究や癌の臨床診断に展開可能なプロテオゲノミクスの手法を開発した。

サンプル採取・調整法とマイクロスケールのプロテオーム解析法

 Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)では、少なくとも100 mgの腫瘍組織を前提として、10,000種類を超えるタンパク質と、サンプルあたり30,000ヶ所を超えるリン酸化サイトのデータを獲得してきた。癌の臨床診断では、急速凍結組織からのコア針バイオプシー (core needle biopsy)で20 mg程度のサンプルをもとに、高深度なプロテオゲノミクスに十分なDNA、RNAおよびタンパク質を抽出する。
  • 研究グループは、高深度なプロテオゲノミクスを行うに足る高品質なDNA、RNAおよびタンパク質の調整を可能とするサンプルを14G (外径 2.11±0.03 mm; 内径 1.69±0.04 mm)の針を介して採取する手法 (Biopsy Trifecta Extraction, BioTExt)を確立した [Fig. 1 a引用下図参照]。Table 1-a
  • またBioTExtに加えて、サンプルあたり25 μgのペプチド量で十分なマイクロスケールのLC-MS/MSによるプロテオームとリン酸化プロテオームの解析を可能とするパイプライン、MiProt、を確立した [Fig. 1 b引用下図参照]。Table 1-b
実証実験
 ERBB2陽性 (HER2陽性)乳癌をモデルとして選択し、患者腫瘍組織移植マウス (PDX)モデルでの予備実験に続いて、14名の患者由来組織について解析を行った。
  • HER2を標的とするヒト化モノクローナル抗体薬トラスツズマブ(ハーセプチン)  によるネオアジュバント(術前補助) 化学療法の開始前と開始後48-72時間にわたって、プロテオゲノミクスを行った。その結果、リン酸化部位として、PDXモデル由来組織と患者由来組織においてそれぞれ>25,000ヶ所と>17,000ヶ所を同定し、11,000種類のタンパク質を同定した。
  • 浸潤巣が完全に消失する病理学的完全奏効 (pathologic complete response, pCR)に達した9名の組織では、ERBB2タンパク質とリン酸化レベルが低減し、mTORの活性も低減することを同定した。
  • pCRに至らなかった (non-pCR)事例について、その原因3種類を同定あるいは推定し、オアジュバント(術前補助) 化学療法に際しての診断の改善と個別化の手ががりとした:
  1. 偽陽性ERBB2事前でのFISHでの判定で陽性であったが、免疫組織化学的方法/IHCで、ERBB2タンパク質の発現は過剰になっていないことを特定。
  2. 疑似陽性ERBB2 - ERBB2は増幅していたが、ERBB2タンパク質の発現レベルとリン酸化のレベルがpCRに比べて低く、また、TOP2Aが発癌ドライバーとして機能している可能性。
  3. ERBB2陽性であるが、ムチン (mucin)タンパク質の過剰発現、アンドロゲン受容体 (AR)シグナル伝達の活性化そしてまたは、癌微小環境における抗腫瘍免疫応答の抑制などにより、耐性を獲得することが示唆された。

[出典] "Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens" Laumont CM, Vincent K [..] Thibault P, Perreault C. Sci Transl Med. 2018-12-05

概要
  • 癌抗原 (腫瘍特異的抗原; Tumor-specific antigens, TSAs)は癌免疫療法の格好の標的であるが、これまでに同定されたTSAsは僅かである。モントリオール大学の研究チームは今回、プロテオゲノミクス (YouTube日本語字幕付き) (proteogenomic Wikipedia引用下図参照)の手法により、proteogenomics
    マウス細胞株とヒト初代細胞においてノンコーディング領域に由来するTSAsを多数同定し、マウスにおいて、今回同定したTSAsを標的とするワクチンが白血病の治療と予防をもたらすことを示した。
背景
  • CD8陽性腫瘍浸潤リンパ球 (tumor infiltrating lymphocyte, TILs)は一般にネオ抗原(腫瘍に特異的な変異を帯びた抗原;  mutated tumor-specific antigens, 以下mTSAs)を認識するとされているが、TILsの一部は、変異を帯びていないが癌細胞に特異的に異常発現する抗原 (aberrantly expressed TSAs, 以下aeTSAs)を認識する。
  • これまでTSAs同定は専ら、腫瘍細胞のエクソーム・シーケンシングから腫瘍特異的変異を同定しMHC結合を予測するreverse immunology の手法に基づくmTSAs同定であった。しかし、この手法による推定mTSAsの偽陽性率が90%にもおよびまた偽陽性率を低減する手法を経て得られるmTSAsは極めて少数に止まっていた。
  • 一方で、適切なハイスループット検出法が存在せず探索が進んでいなかったaeTSAsには、腫瘍型特異性が高いmTSAsに対して、腫瘍型共通性が高いことを期待できる。また、エクソームはゲノムの2%に止まりゲノムの75%が転写・翻訳され、癌変異の99%がノンコーディング領域で同定され、ノンコーディング領域から多数のMHCペプチドが翻訳され、その一部がTILsと自己反応性T細胞の標的であることが報告されている。
マウス細胞株とマウス免疫 (樹状細胞ワクチン)
  • 研究チームは、RNA-seq、LC-MC/MSおよびデータ蓄積・解析に基づくプロテオゲノミクスのワークフローを開発し(原論文Fig. 1参照)、大腸癌細胞株CT26とマウスリンパ腫・Tリンパ球様EL4細胞株の2種類のマウス癌細胞株においてmTSAsに加えてaeTSAsを探索した。
  • マウス細胞株からmTSAs6種類とaeTSAs11種類を発見し、そのうちEL4細胞由来の抗原でパルスした樹状細胞でC57BL/6マウスを2回免疫し、抗原依存で150日生存率が10%から100%に至り、また、新たなEL4細胞に対する抵抗性が付与されることを見出した。また、このTSAワクチンがもたらす抗腫瘍性応答は、TSAs発現量と免疫前レパトアにおけるTSA応答T細胞の頻度の2種類のパラメーターに依存することも見出した。
ヒト初代細胞の結果を加えたTSAsランドスケープ
  • マウス細胞株に続いて、ヒトについても、エクソン変異が極めて少数のB-ALL初代細胞4種類と肺癌由来初代細胞3種類から、2種類のmTSAsに加えて、20種類のaeTSAsを同定した。
  • 以上、マウスとヒトの39 TSAsのうちタンパク質コーディング領域由来は4種類であった。一方で、2種類がコーディング・エクソンのアウト・オブ・フレーム翻訳由来、33種類がノンコーディング領域由来であり、そのほとんどに変異は見られなかった。すなわち、今回見出したTSAsの90%がこれまでのエクソームの変異に注目したmTSAs探索では見落とされていたaeTSAsであったことになる。
  • マウスTSAワクチンの効用に影響を与える2種類のパラメーターはヒト細胞でも測定可能なことから、臨床応用にあたってワクチンの標的として有望なTSAsの選定も実現可能と思われる。

[出典] “Genomic Determinants of Protein Abundance Variation in Colorectal Cancer Cells.” Roumeliotis TI et al. Cell Rep 2017 Aug 29;20(9):2201–2214. bioRxiv. Posted December 9, 2016.

概要

  • ゲノム変異がタンパク質ネットワークに、ひいては細胞生理活性に、どのようにどのような影響を与えるかを理解することから、癌の不均一性の由って来る所以を理解することが可能になる。サンガー研究所とEBIを中心とする英、オランダ、独の共同研究チームは今回、ゲノム変異と癌の不均一性とをタンパク質発現量を介して紐づけることを目指して、50種類の大腸癌細胞株のパネル(COREAD)を対象とするゲノミクス、トラスクリプトミクスおよびプロテオミクスの統合的解析を行った。
  • COREADについてはこれまでに、全エクソームシーケンシングと、遺伝子発現、コピー数およびメチル化のプロファイリングが行われていたところ、今回、アイソバリック標識法(isobaric labeling)とトライブリッド質量分析によって、大腸癌細胞株あたり平均9,410種類のタンパク質と11,647種類のリン酸化ペプチドを、細胞株間で相対的に定量した。
  • ゲノム、トランスクリプトームに加えてプロテオームとリン酸化プロテオームのデータセットにさらに公的データベース群を融合することで、下図左のGraphical AbstractFigure 1にあるように、発現量から見たタンパク質の共変異ネットワーク(Protein co-variation network, Figure 1に拡大図)を構築し、遺伝子変異がタンパク質の発現量に直接与える影響(direct effects)と変異タンパク質から相互作用するタンパク質へと広がる間接的影響(collateral effects by protein co-regulation)を分析し、さらに、癌細胞のプロテオームの特徴から抗癌剤応答を予測するPharmacoproteomic Models(下図 Figure 7)を構築した。

Protein Abundance Variation in Colorectal Cancer Cells 1 Protein Abundance Variation in Colorectal Cancer Cells 2

タンパク質間相互作用

  • プロテオームのデータ解析では、COREADパネル内で発現量が共変化するタンパク質(co-variation)に注目した。COREADパネルの80%以上の細胞株に存在した8,295タンパク質のペアワイズ相関に基づくタンパク質間相互作用のネットワーク解析をweighted correlation network analysis (WGCNA)によって行った。
  • WGCNAネットワークは、既知のタンパク質複合体やタンパク質間相互作用(CORUM登録の7,248種類とSTRING登録の20,969種類)を含む87,420組のタンパク質間相互作用で構成されたが、ネットワーク上で、284種類のタンパク質モジュール(メンバータンパク質数3〜1,012)を識別するに至り、それぞれにGOを始めとする公共データベースを参照し機能アノテーションを加えた。
  • 挿入図Figure 1は、大腸癌タンパク質ネットワークにおいて、メンバーのタンパク質数が50個以上のモジュールと主要なアノテーションである[参照DB:GOCORUMKEGGGOBP-slimGSEAおよびPfam
  • このWGCNAネットワークにタンパク質発現量をマップすることで、各細胞株の生物学的特徴を判別可能にするco-variomeを構築した。リン酸化プロテオームのデータ解析からは、共リン酸化タンパク質の分析により、キナーゼと基質の相関をde novoで予測可能にする手がかりを得た。

ゲノム変異とタンパク質発現量の相関

  • 遺伝子変異とDNAコピー数異常がタンパク質発現量に直接影響を及ぼすのはプロテオームの一部であることが示唆された。例えば、ミスセンス変異は、TP53を例外として、タンパク質発現量にはほとんど影響を与えない。また、ナンセンス変異は、mRNAの分解に加えて、翻訳そしてまたは翻訳後修飾の過程で、タンパク質発現のさらなる下方制御につながって行くことが示唆された。
  • 特定の遺伝子の変異の影響が、タンパク質間相互作用を介して、他の遺伝子の産物タンパク質へと及んで行くという仮説をたて、強く共変化するタンパク質ペアからなるmutation-vulnerable networkを構築した。このサブネットワークは特定のタンパク質発現の遺伝子変異による下方制御によって、それと相互作用するタンパク質発現が下方制御される関係を表現しており、306タンパク質と278の相互作用で構成され、少なくとも10種類のよく知られたタンパク質複合体を含んでいる。
  • 例えば、BAF複合体およびPBAF複合体と、クロマチン再編成タンパク質(ARID1A, ARID2およびPBRM1)との関係であり、CRISPR-Cas9によるノックアウト実験で、この関係を検証した。また、タンパク質発現の調節が、mRNAレベルの調節とは独立な現象も改めて確認した。

プロテオミクスに基づいたCOREADの分類

  • 細胞株間で変異が大きい上位30%のタンパク質2,161種類の発現量プロファイルに基づいたCOREAD大腸菌細胞株のクラスタリングを試み、これまでの大腸癌分類体系を整合しつつより精密なサブタイプの定義が可能なことを示した。

薬剤応答推定モデルの構築

  • ゲノム変異、メチル化、遺伝子発現、プロテオームおよびリン酸化プロテオームの特徴を入力とするElastic Net Modelに基づく、50種類の大腸癌細胞株の抗癌剤265種類(市販薬48種類、治験薬76種類, 実験的低分子141種類)に対する薬剤応答モデルを構築・評価した。その結果、挿入図Figure 7-Bにあるように抗癌剤ごとに特異的なデータモデルによって薬剤応答が推定されることを見出した。プロテオミクスに基づくデータモデルでは、薬剤排出トランスポーターABCB1ABCB11の発現量が特徴量となっていた。

COREADプロテオミクス・リン酸化プロテオミクスデータ・FTPサイト


関連論文


(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/09/20)
  • プロテオミクスをゲノミクス(さらには、トランスクリプトミクス、リン酸化プロテオミクス)に重ね合わせて、癌の分子基盤を解き明かす試み2編 
    Cell 論文 corresponding authors: Daniel W. Chan (Johns Hopkins Medical Inst.); Karin D. Rodland (Pacific Northwest National Lab.) 
    Nat. Common. 論文 corresponding authors: Ernst Lengyel (U. Chicago); Matthias Mann (MPI Biochemistry)
  • [Cell 論文]
    • Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) の研究成果。
    • 癌シーケンシングプロジェクトであるThe Cancer Genome Atlas (TCGA)由来の169種類の悪性度が高い漿液性卵巣腫瘍(high-grade serous ovarian cancer, HGSOC)(*)を含む174種類の卵巣腫瘍のプロテオームを液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS/MS)によって測定し、同定・定量化したタンパク質9,600種類のうち全てのHGSOCサンプルに存在した3,586タンパク質を対象として、プロテオミクスとトランクリプトミクスの統合解析を行った。また、69種類についてはリン酸化プロテオミクスのデータを取得し統合解析に利用した。 
      (*) 原論文とRESEARCH HIGHLIGHTSでは略語としてHGSCs (high-grade serous carcinomas) が使われている。
      • HGSOCの特徴であり染色体不安定性の指標である体細胞におけるコピー数多型異常(copy number alternatoins, CNA)がタンパク質の量に与える影響:異なる染色体上の4領域に存在するCNAsが、翻訳後修飾を介して200を超えるtrans にタンパク質の量を調節することが示唆された。これらのタンパク質は癌の進行をもたらすプロセスに集中し、臨床データとの重ね合わせからCNA領域と予後が相関することが見られた。
      • 遺伝子の相同修復機構の欠陥とヒストンH4のアセチル化が相関し、このアセチル化を指標として患者を層別化可能なことを見出した。
      • リン酸化ペプチドを定量化しPID(pathway interaction database)のパスウエイにマッピングし、リン酸化タンパク質、タンパク質またはmRNAのレベルに基づいてパスウエイをランク付けし、全生存期間との相関を見ることから、短い全生存期間の患者由来のサンプルにおいて活性化している15種類のシグナル伝達ネットワークを同定した(トランスクリプトミクスのデータの解析から同定できたのは1種類のネットワーク)。
  • [Nat. Common. 論文]
    • 8種類のHGSOC組織、30種類の細胞株(浸潤性卵巣腫瘍26種、子宮頸癌2種、不死化卵巣表層上皮細胞2種)、および卵管上皮初代細胞3種)のプロテオームをLC-MS/MSで解析。
    • 10,000を超すタンパク質の定量化に基づいて細胞株は3つのカテゴリーに分類された:上皮細胞;明細胞;間葉系細胞
    • 今回測定したプロテオームデータに加えてCPTAC/TCGAのプロテオームデータセットを、上皮性と間葉系の腫瘍クラスターへと明確に層別化する67種類のタンパク質で構成される指標(signature)を同定した。
    • プロテオミクスに基づく細胞株と腫瘍組織双方の層別化は、HGSOCの起源(卵管由来か卵巣表層上皮由来か)とHGSOCドライバータンパク質への手がかりを与えた。また、今回開発使用した効率的かつ高感度なプロテオミクス解析ワークフローの有用性が実証された。

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