タグ:プロテオミクス

[出典]
  • [News & Views] Predicting health and life span with the deep plasma proteome. Emilsson V, Gudnason V, LL Jennings.Nat Med. 2019-12-05.  
  •  [論文1] Undulating changes in human plasma proteome profiles across the lifespan. Lehallier B [..] Wyss-Coray T. Nat Med. 2019-12-05 (bioRxiv. 2019-09-01). 
  • [論文2] Plasma protein patterns as comprehensive indicators of health. Williams SA [..] Ganz P, Wareham NJ. Nat Med. 2019-12-02.
 老化は器官の劣化を伴い慢性疾患のリスク因子である。これまでに、老齢マウスを若齢マウスの間でparabiosis( 並体結合)により血液循環を共有させると老齢マウスの脳を始めとする多くの器官が若返り、また、若齢マウスの血漿を老齢マウスに注入することでも脳の老化が抑制されることが、報告されてきた。それとともに、この現象に関与する因子として、血中を循環するタンパク質が注目を集めてきた。

 今回、Lehallier (Stanford U)らWilliams (SomaLogic)ら、それぞれの国際共同研究グループが、ヒト血漿中の数百のタンパク質と一連の健康アウトカムとの対応関係を、SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers) [1-4]に基づいたSomaScan技術によって探った。通常のアプタマーではなくSOMAmer/SomaScan技術を利用することで、単一の血液サンプルから5,000種類のタンパク質を定量可能なことは、先行研究で、実証されていた [5-6]

[論文1] 

 INTERVALコホート (Lancet, 2017)とLonGenityコホート (Am J Cardiol, 2017)に由来する4,331名の健常者 (18-95歳)を対象として、2,925種類の血漿タンパク質のレベルを測定し、年齢とともにレベルが変動する (age-related changes)タンパク質 (以下、A - P)1,379種類を同定した。
 その結果、年齢に応じたA - Pの変動の仕方がタンパク質ごとに異なるが (軌跡が異なるが)、年齢に対して線形に変動するA - P2種類と非線形に変動するA - P群6種類に分類できることを見出した。その上で、プロテオームとしての変動を数値化したところ、変動のピークが、34歳、60歳および78歳の年齢に出現した (News & Views Fig. 1引用下図 a 参照)。
  • 注目すべきことに、1,379種類のタンパク質のうち895種類は男女間で有意に異なっおり、男性と女性の老化過程が異なることを裏付け、また、性が実験パラメーターとして必須であることが改めて証明された。
  • GOとKEGGに基づくパスウエイ解析から、性によって変動するタンパク質の機能については、さらに多くのタンパク質を解析する必要が示唆されたが、A - Pについては、血液に関連するパスウエイに関与するタンパク質が多く見られた。
  • 続いて、血漿プロテオームのデータに基づいて生物学的寿命を推定する線形モデルの開発を試み、性差が見られない373種類のタンパク質を'部品'とする'proteomic clock' (以下、 ProteC)を定義することに成功した。興味深いことに、ProteC推定年齢が実年齢よりも若い集団は、実年齢相応には衰えていない認知機能と身体機能を示した。また、このモデルの部品を9種類にまでにとどめでも推定精度はほとんど変わらなかった。
  • マウスについても1,305種類のタンパク質をSomaScanで測定解析し、172種類のA - Pを同定し、そのうち46種類がヒトのA - Pと相同であり、また、その多くが異時性並体結合実験において老齢・若齢マウスで変動するタンパク質であった。
  • 研究グループはさらに、軌跡A - P間で異なることに注目した。各タンパク質の年齢に依存する軌跡をクラスタ分析し、冒頭にあったように、線形な軌跡2種類と、非線形な軌跡6種類の計8種類のクラスタを識別し、そのうち6種類が、特定のパスウエイに対応することを同定した。例えば、血液の中でマイクロパーティクルに存在するタンパク質群のレベルは年齢とともに一様に減少し、他の血液関連パスウエイのタンパク質群 (例 ヘパリン結合、グリコサミノグリカン結合)のレベルは、年齢とともに2段階で上昇し、軸索ガイダンスとEPH-エフリンシグナル伝達に関与するタンパク質群のレベルは60歳までほぼ一定でその後指数関数的に上昇した。
  • 年齢に対してそのレベルが非線形で変化するタンパク質の軌跡を数値化するために、新たなソフトウエア (differential expression-sliding window analysis , DE-SWAN)を開発し、各年齢で発現レベルが有意に変動するタンパク質数を年齢に対してプロットしたところ3つのピークが現れ、その年齢で血漿プロテオームが大きく変動することを示した。また、それぞれのピークを構成するタンパク質セットは変動した。このそれぞれのピークに貢献するタンパク質が関与するパスウエイおよび疾患についても分析し、パスウエイについては34歳と60歳のピークでは線形モデルと非線型モデルの結果が重なりあい、また、例えば、アルツハイマー病に関連するタンパク質は34歳のピークには貢献せず、60歳/78歳のピークに貢献することを見出した。
  • [関連Webサイト] Aging Plasma Proteome
  • [関連ブログ] NIH Director's Blog: Aging Research: Blood Proteins Show Your Age. Posted on December 17th, 2019 by Dr. Francis Collins. 
  • [厄年] "厄年てーと数えで、男は25、42、61、女は19、33、37といわれているんだな。なにせ、寿命が短けい時からのはなしなんで、男の厄の61を78に当てはめてみるとな、厄はそれぞれ32、54、78になるって寸法よ、血漿プロテオームやらの'変動'と辻褄あうじゃね〜か"、おあとがよろしいようで。
[論文2] Williams

 5種類の互いに独立なコホートからの16,894名について~5,000種類の血漿中タンパク質を分析し、そのデータにもとづいて、将来の循環器疾患、糖尿病、脂肪肝、運動性などの健康関連アウトプットを予測するための教師付き機械学習モデルを開発し、分析した13種類のフェノタイプのうち11種類について予測するに足るタンパク質パネルの構築に成功した。これらのパネルは、13種類から375種類の血漿タンパク質で構成された。

[論文1の参考文献]
  1. Somalogic blog 2016-03-08
  2. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 2010 Dec 7;5(12):e15004
  3. From SOMAmer-Based Biomarker Discovery to Diagnostic and Clinical Applications: A SOMAmer-Based, Streamlined Multiplex Proteomic Assay. Kraemer S [..] Sanders G. PLoS One. 2011;6(10):e26332. Online 2011 Oct 17.
  4. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Oct; 3(10): e201. Online 2014-10-07
  5. Co-regulatory networks of human serum proteins link genetics to disease. Emilsson V [..]  Gudnason V. Science. 2018 Aug 24;361(6404):769-773. Online 2018 Aug 2.
  6. Genomic atlas of the human plasma proteome. Sun BB [..] Butterworth AS. Nature. 2018 Jun;558(7708):73-79.  Online 2018 Jun 6.

出典 "Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues" Saka SK, Wang Y [..] Yin P. Nat Biotechnol. 2019-08-19; Press Release "Lighting up proteins with Immuno-SABER" Wyss Institute 2019-08-19

背景
 Peng Yin (Wyss Institute/HMS)らは、短いDNAプライマー配列を多数連結した長いコンカテマー (concatemers)の合成を可能にするPrimer Exchange Reaction (PER) [1]を開発し2017年Nature Chemistry誌に発表した。続いて、PERに蛍光標識したオリゴヌクレオチドを多重に結合し、いわばDNAを増幅器として利用することで、FISHのシグナルを大きく増幅しDNA/RNAの高感度多重検出を実現し、この手法をSignal amplification by exchange reaction (SABER) [2]として2019年5月Nature Methodsオンライン版に発表した。
注:本項と次項の[1]~[5]に対応する論文へのリンクと、関連して公表されたプレス発表および紹介ビデオへのリンクの一覧を、本記事文末に掲載しました。

概要
 Peng Yinらは今回、SABERをもとに、2014年にNature Methods誌に発表していたExchange-PAINT [3]の技術に倣い、さらに、今回共著者のEdward Boyden (MIT)らが開発したExpand Microsocply [4]を組み合わせることで、多重タンパク質 (論文では10種類まで)の同時可視化を実現するイミュノセーバー/Immuno-SABER [5]を開発し、2019年8月19日Nature Biotechnology誌オンライン版に発表した。

Immune-SABERの基本型
  • 標的タンパク質に結合する抗体をDNAバーコードで標識する。このDNAバーコードに前述のSABERコンカテマーを結合する。SABERコンカテマーに繰り返されている同一配列に対して、相補的な配列を持ち蛍光標識されたオリゴヌクレオチド (“imagers”)が結合することで、標的タンパク質に結合した抗体からのシグナルが、大きく増幅される。
  • 研究グループは、このImmune-SABERによる複数タンパク質の高感度な同時検出を、培養細胞から始まり、凍結組織切片ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片、そしてホールマウントサンプルに至るまで、実証した。
Exchange-SABER
  • DNA-PAINT技術を多重化したExchange-PAINTに倣って、Immuno-SABERを多重化したExchange-SABERの手法を開発した。Exchange-SABERでは、標的とするタンパク質群の“imagers”セットを洗浄し他の“imagers”セットに置き換えることを繰り返す。
  • Exchange-SABERを介して、マウス網膜の凍結切片において10種類のタンパク質の可視化を実証した。
Branched SABER
  • 第1のPERで作出する直鎖状のコンカテマーと、この直鎖状コンカテマーに第2のPERを介して新たなコンカテマーを枝のように付け加えた枝分かれコンカテマー (branched SABER)とを併用することで、細胞内で希なタンパク質から豊富なタンパク質まで同時に可視化することを可能にした。すなわち、豊富なタンパク質には直鎖状コンカテマーを向け、希なタンパク質になるほど多くの枝を帯びたbranched SABERを向ける。
  • この手法によって、ヒト扁桃腺において、量も細胞局在も異なる6種類のタンパク質の同時可視化を実現した。
Expansion-SABER 
  • さらに、Exchange-SABERにExpansion Microscopy (ExM) を組み合わせることで、多重度もスループットも分解能もこれまでになく高いタンパク質のマッピングが可能になった。
[論文;プレス発表;紹介ビデオ]
  1. Primer Exchange Reaction (PER):"Programmable autonomous synthesis of single-stranded DNA" Kishi JY, Schaus TE, Gopalkrishnan N, Xuan F, Yin P. Nat Chem. 2018 Feb;10(2):155-164. Online 2017-11-06;Wyss Instituteプレス発表 2017-11-06 Autonomously growing synthetic DNA strands;紹介ビデオ(1m40s)   
  2. Signal amplification by exchange reaction (SABER):"SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues" Kishi JY, Lapan SW, Beliveau BJ, West ER [..] Cepko CL, Yin P. Nat Methods 2019 Jun;16(6):533-544. Online 2019-05-20;Wyss Instituteプレス発表 2019-05-20 紹介ビデオ(2m12s) 
  3. Exchange-PAINT/DNA-PAINT:"Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT" Jungmann R, Avendaño MS, Woehrstein JB, Dai M, Shih WM, Yin P. Nat Methods. 2014 Mar;11(3):313-8. Online 2014-02-02;Wyss Instituteプレス発表 2014-02-03 Capturing ultrasharp images of multiple cell components at once.
  4. 組織内部を10-20 nmの分解能で観察可能にしたExpansion Microscopy: "Expansion microscopy" Chen F, Tillberg PW, Boyden ES. Science. 2015 Jan 30;347(6221):543-8. Online 2015-01-15;紹介ビデオ(3m13s)   
  5. イミュノセーバー(公開紹介論文):"Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein imaging in tissues" Saka SK, Wang Y [..] Yin P. Nat Biotechnol. 2019-08-19;Wyss Instituteプレス発表2019-08-19 紹介ビデオ(2m20s)
  6. [6] ライトセーバー (Lucasfilm):紹介ビデオ(3m3s) 音量に注意 

[出典] "Comprehensive identification of RNA–protein interactions in any organism using orthogonal organic phase separation (OOPS)" Queiroz RML, Smith T, Villanueva E [..] Lilley KS. Nat Biotechnol. 2019-01-03.
  • ハイスループットでRNA結合タンパク質 (RBPs)を同定するこれまでの手法はポリアデニル化されたRNAsを標的としており、ポリアデニル化されていないRNAs (lncRNA、mRNA前駆体、バクテリアのRNAs)に結合するタンパク質を捕捉することができない。また、この課題を塩基修飾で回避する手法はバイアスを伴う。
  • University of Cambridge、MRC Laboratory of Molecular BiologyならびにUniversity of Yorkの英国研究チームは今回、任意の生物においてRNA-タンパク質相互作用を網羅的に同定することを目指して、acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (AGPC)  法をもとに、orthogonal organic phase separation (OOPS)法を開発した。
  • AGPC法は (crisp_bio注: 下図参考図参照)、サンプルを水相と有機相に分離し、RNAが水相 (aqueous phase)へ、DNAやタンパク質が有機相 (oragnic phase)に移動することを利用して、イソプレパノールを介したバイアスを伴わないRNA沈殿と、guanidinium thiocyanateを介したタンパク質変性を誘導する手法である。AGPC
  • OOPSでは、UV (254 nm)架橋によりRNA-タンパク質の付加体が形成され水相と有機相の界面の領域 (interphase)に移動すると想定し、互いに結合していないRNAsとタンパク質に加えて、界面領域からのRBPsまたはタンパク質結合RNAs (PBRs)の同定を試みた。
  • OOPSをヒトのHEK293細胞、U2OS細胞およびMCF10A細胞において検証し、読み出したタンパク質の96%がRNAに結合し、全てのlncRNAsがタンパク質と架橋されることを見出した。
  • 同定した1,838種類のRBPsには、926種類の新奇RBPs候補が含まれており、OOPSの感度は従来のRBPs同定法のほぼ100倍に達した。
  • OOPSによってまた、U2OS細胞において微小管重合阻害剤ノコダゾールによる細胞周期アレストがRNA-タンパク質相互作用に及ぼす影響を解析し、さらに、バクテリア (E. coli)のRNA-インタラクトーム (RBPome)解析も実現した。

[出典] "SubCellBarCode: Proteome-wide Mapping of Protein Localization and Relocalization" Orre LM, Vesterlund M, Pan Y, Arslan T [..] Lehtiö J (Karolinska Institutet). Mol Cell. 2019-01-03;WebサイトSUBCELL BARCODE - A web portal to proteome sub cellular localization (下図画面キャプチャ参照)SUBCELL BARCODE
  • 解析パイプライン:細胞コンパートメントを5種類の細胞分画*に分離したサンプル2セットについて、低発現タンパク質の検出も可能な高深度 (in-depth)な10セットの定量的質量分析 (HiRIEF-LC-MS)を経て得られる各タンパク質ごとの分画プロファイルに基づき、細胞内の局在を特定する (* 各細胞分画に濃縮が想定される細胞コンパートメントは例えば、サイトゾル・細胞骨格、核・ミトコンドリア・細胞膜、など)。
  • 測定:5種類のヒト細胞 (表皮癌由来A431; 乳腺癌由来MCF7; アストロサイトーマU-251; 細気管支肺胞上皮癌NCI-H322; 肺腺癌HCC-827)を対象とする50 (10セット x 5)回測定し、結果的に、5細胞全てに共通するタンパク質8,140種類を含む12,418種類のタンパク質(遺伝子)の分画プロファイルを得た (原論文 Figure 1- Cの表参照)
  • 局在化の判定:共通タンパク質8,140種類の中で、5種類の細胞株全てにおいて分画プロファイルが安定しているタンパク質3,365種類をマーカと位置付けることで仮説によらずデータ駆動型の局在化解析を試みた。はじめに、分画プロファイルをt-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding)により解析しmclustを介して、マーカタンパク質を15種類のクラスタに分類した。続いて、15クラスタに分類された遺伝子を対象とするGene Ontology (GO)とUniProtの細胞コンパートメントのアノテーションのエンリッチメント解析から、15クラスタをそれぞれ特定の細胞コンパートメントを割り付け、加えて、4種類の領域 (原論文では"neighborhoods")に大別しそれぞれ、 分泌系、核、サイトゾルならびにミトコンドリアと定義した(原論文Figure 1-E参照)。その上で、全タンパク質を15クラスターと4領域に帰属させた。
  • 各タンパク質のクラスターまたは領域への相対的帰属確率をそれぞれ積み上げ棒グラフに色分けして表示するとバーコードが見えることから、今回“SubCellBarCodes”と称するに至った (EGFRバーコードの例 原論文Figure 3 A 参照)。今回単一コンパートメントに局在と判定したタンパク質7,589種類については、GOUniProtとの領域レベルで、Cell Atlas (抗体を利用した解析結果)ならびにCOMPARTMENTSとの細胞コンパートメントレベルでの整合性を検証し、みられた差異について論じた。
  • また、各タンパク質の細胞特異的局在化、キナーゼやE3リガーゼなどのタンパク質クラスの細胞内分布、タンパク質を構成するドメインからみた局在化、タンパク質複合体の膜への共局在、および、選択的スプライシングがタンパク質局在化に与える影響についても論じた。
  • さらに、HCC-827細胞株においてEGFR阻害剤 (ゲフィニチブ)投与に応じたタンパク質の再局在化を明らかにした(原論文Figure 7参照)。すなわち、今回構築したパイプラインにより特定の条件下でのタンパク質細胞内局在の動態 (時空間調節機構)の解析が可能なことを示し、SubCellBarCodesの手法を、翻訳後修飾、体細胞変異、生殖細胞系列変異などがタンパク質局在に与える影響の分析にも展開可能とした。

[出典] "Real-time measurement of protein–protein interactions at single-molecule resolution using a biological nanopore" Thakur AK, Movileanu L (Syracuse University). Nat Biotechnol 2018-12-10.

背景
センサーの構造
  • センサーは、バイオ・ナノポアの本体にあたる単量体βバレル構造のスキャフォールドと、タンパク質受容体をバイオ・ナノポアへ繫ぎ止めるためのフレキシブルなペプチド鎖(GGSGGS)を基本構造とする。
  • ポアであるスキャフォールドは、大腸菌外膜においてフェリクローム  に結合した鉄を輸送する受容体を短縮した455残基のt-FhuA (truncated Ferrichrome-iron Receptor Precursor)である (FhuAのPDB登録構造下図参照)。PDB 1BY3
  • PPIは、タンパク質受容体に対するリガンドの結合または遊離に応じて変化するバイオ・ナノポアを介して流れる膜貫通電流の変化に基づいて同定する。
実証実験
  • リボヌクレアーゼの一種で112アミノ酸からなるバーナーゼ barnase (Bn) をタンパク質受容体とし、Bnの活性を阻害する89残基のバースター(barstar, Bs)をリガンドとするモデルにて実証 (Barnase-Barstar複合体参考文献: PubMed 20211732)
  • Bn-Bsに特異的な相互作用への感度向上の観点から、センサー基本構造に対してBnのN末端にOペプチド・アダプターを追加。
  • Bnの結合はバイオ・ナノポア自体に影響を与えない
  • Bsの可逆的結合を同定
  • Bnに対する野生型のBsと結合親和性が低い変異型Bs (D29A)の結合親和性の差異同定を実現
  • ウシ胎児血清中でのBn-Bs結合解析を実現し、細胞溶解物、血液および生検試料でのPPI解析ツールとしての可能性を呈示
今後の展開
  • バイオ・ナノポアの多重並列化により、多様なタンパク質受容体のPPI多重同時測定や、ハイスループットな低分子薬剤やペプチド阻害剤スクリーニングへと展開
固体ナノポアまたはバイオ・ナノポアを利用したタンパク質センサー開発の試み
  • "金属化 (metabolized)窒化ケイ素ナノポア + ニトリロ三酢酸受容体"センサー: "Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores" Wei R, Gatterdam V, Wieneke R, Tampé R, Rant U. Nat Nanotechnol. 2012 Mar 11;7(4):257-63.
  • "α溶血素 (αHL)タンパク質ナノポア + 15-mer DNAアプタマー"センサー:"Protein Detection by Nanopores Equipped with Aptamers" Rotem D, Jayasinghe L, Salichou M, Bayley H. J Am Chem Soc. 2012 Feb 8;134(5):2781-7. Online 2012-01-26.
  • "ΑHLナノポア + ATP依存性プロテアーゼunfoldase"センサー:"Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore" Nivala J, Marks DB, Akeson M. Nat Biotechnol. 2013 Mar;31(3):247-50. Online 2013-02-03.
  • "溶血毒素Fragaceatoxin C (FraC)ナノポア"センサー:"Electro-osmotic capture and ionic discrimination of peptide and protein biomarkers with FraC nanopores" Huang G, Willems K, Soskine M, Wloka C, Maglia G. Nat Commun. 2017 Oct 16;8(1):935.

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