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[PERSPECTIVE] Molecular messages in human microbiota. Henke MT, Clardy J. Science. 2019-12-13.
 Harvard Medical School 生物化学・分子薬理学部のJ. Clardyらが、Science Perspectiveにて、対照的な手法によりマイクロバイオームに由来する低分子の機能解析を実現したSciencイタ誌掲載2論文を紹介した。

1. メタゲノムデータから生合成遺伝子クラスタを直接発見するMetaBGC
[出典] A metagenomic strategy for harnessing the chemical repertoire of the human microbiome.  Sugimoto Y,  Camacho FR [..] Donia MS. Science. 2019-12-13
 ヒトのマイクロバイオームとヒトの健康および疾病との連関を示唆するデータが急速に蓄積されつつあるが、その分子機構の鍵を握っているのがマイクロバイオームから生産される低分子である。
 バクテリアにおいて低分子を生合成する遺伝子群は、ゲノム上で生合成遺伝子クラスタ (biosynthetic gene clusters, BGCs)と呼ばれるクラスタを形成している。Princeton Universityの研究グループは、モジュラー型の確率モデルに基づいて、分離培養可能な菌株のゲノム解析に依存することなく、マイクロバイオームからのメタゲノムデータから直接BGCsを同定するツール、metagenomic identifier of biosynthetic gene clusters (MetaBGC)を開発し、ヒト・マイクロバイームのメタゲノムデータから直接 II型ポリケタイド BGCsを同定し、実験検証も行った。
  • MetaBGCは、多様な微生物ゲノムが混在する複雑なメタゲノムデータから生合成酵素のホモログを同定するための確率モデル MetaBGC-Build、ヒト・マイクロバイオームの数千件のシングルリード・レベルのデータから生合成遺伝子を同定する MetaBGCーIdentify、解析対象マイクロバイオームにわたる生合成リードの定量化 MetaBGC-Quantify、およびクラスタリング MetaBGC-Clusterで構成される。
  • MetaBGCを、米国・スペイン・デンマークの西欧系と中国とフィジーの非西欧系の人類集団に由来する腸・口腔・皮膚・膣のメタゲノム3,203サンプルに適用し、II型ポリケタイドをコードしている可能性がある完全なBGCs 13種類を発見した。
  • 13種類のうち8種類は、ヒト・マイクロバイオームから分離された菌株ゲノムに分散してコードされており、5種類はこれまで明らかにされてきたバクテリアの配列データには見られない配列で構成されていた。
  • II型ポリケタイドBGCsは、腸、口腔および皮膚のマイクロバイオームで見出され、宿主に定着した状態で転写され、異なる人類集団に広く分布していた (なお、コホートにおける健常な米国人46%の腸、口腔または皮膚のマイクロバイオームには、少なくとも1種類のII型ポリケタイドBGCが見られた)。
  • 続いて、口腔マイクロバイオームと腸マイクロバイオームで発見した2種類のII型ポリケタイドBGCsについて合成生物学の手法で実験検証した。すなわち、メタゲノムから発見したBGCsを再構成し、由来する菌株を探索することなく、さまざまな宿主バクテリアで発現させ、産物を解析した。この手法により、解析した2種類のBGCsから5種類の新奇II型ポリケタイド分子を精製し、構造を決定することに成功した。さらに、2種類の分子は、その分子を生産するマイクロバイオームと同じニッチに存在するバクテリアに対する抗菌性を発揮することを同定した。すなわち、II型ポリケタイド分子が、マイクバイオームにおけるバイクテリア間の競合に関するメッセージを帯びていることが示唆された。
2. CRISPR-Cas9遺伝子ノックアウトから始めるマイクロバイオーム由来分子の機能同定
[出典] Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics. Guo CJ [..]  Spitzer MH, Fischbach MA. Science. 2019-12-13
 腸マイクロバイオームと宿主の相互作用の分子機構の解明が進みつつある。腸マイクロバイオームが生産する多数の分子の中にGPCRや核内ホルモン受容体に対するリガンドが見出され、そうした分子を介して腸マイクロバイオームが宿主の免疫応答や代謝に影響を及ぼすことが徐々に明らかにされつつある。
 Stanford University, UCSFなどの研究グループは今回、はじめに、これまで遺伝子操作が特に困難であった嫌気性フィルミクテス門のクロストリジウム綱バクテリアの遺伝子ノックアウトを、CRISPR-Cas9システムの2成分 (Cas9; gRNAとDSB修復用テンプレート) にて送達する条件を最適化することで実現した。
 こうして、変異株と野生型の対照実験を容易にし、腸マイクロバオームと宿主の相互作用を担う分子を、特定の菌株または代謝経路に帰属させる手法を実現した。嫌気性フィルミクテス門バクテリアは、腸マイクロバイオームの中でも多数の分子を生産することから、今回確立した手法は、マイクロバイオームに由来する分子の解析を大きく前進させる。また、この手法は、CRISPR-Cas9システムの個別最適化が必要にはなる可能性があるが、他の特定の微生物集団に由来する分子機能の解析へ展開できる。
  • ヒト腸内常在クロストリジウムのモデルとしてスポロゲネス菌 (Clostridium sporogenes)を選択し、CRISPR-Cas9により10種類の分子 (*)の生産のノックアウトを試み、対応する代謝産物が培養抽出物に存在しないことを、液体クロマトグラフィー/質量分析とガスクロマトグラフィー/質量分析により、確認した [(*)10種類の分子は、主としてあるいは選択的に腸マイクロバイームに見られる]。
  • 続いて、無菌マウスに、スポロゲネス菌の野生株、または、CRISPR-Cas9ノックアウトを介して特定の代謝産物を生産しなくなった5種類の変異株を、それぞれ定着させ、変異株を定着させたマウスにおいて、それぞれの変異株に特異的な代謝産物がマウスに見られず、他の代謝産物は見られることを、確認した。
  • さらに、分枝鎖短鎖脂肪酸 (short-chain fatty acids, SCFAs)を生産しないようにした変異株を定着させたマウスにはSCFAsが見られないことに加えて、免疫グロブリンA (IgA)を発現する形質細胞が、野生株定着マウスに比べて増加し、また、自然免疫系細胞の表面に結合するIgAのレベルも高まることを見出した。分岐鎖SCFAs (腸内バクテリアからのメッセージ)による宿主の免疫の制御は、これまで知られていなかった現象である。

[出典] Large-Scale Analyses of Human Microbiomes Reveal Thousands of Small, Novel Genes. Sberro H [..] Bhatt AS. Cell. 2019 Aug 22;178(5):1245-1259.e14. Online 2019 Aug 8. (bioRxiv 2018-12-13); PREVIEW Tiny Hidden Genes within Our Microbiome. Mittelman K, Burstein D. Cell. 2019-08-22

背景
  • 従来のバクテリアゲノムのアノテーションでは無視されてきた短いORF (smORFsまたはsORFs)について、近年、それに由来する短いペプチド (smORF-encoded peptides: SEPs)が存在し、かつ、機能を帯びているとするデータが蓄積され始めた [1]
  • Stanford Universityを主とする研究グループは今回、50アミノ酸以下の大きさのタンパク質をコードするsORFsに注目し、それに由来する小型タンパク質 (以下、sPRO)とその機能をin silico解析した。
sORFsファミリーの検出と新奇性
  • NIH Human Microbiome Project (HMP)のデータセットから、健常人236人の4ヶ所の部位 (口腔; 皮膚; 腸; 膣)に由来する1,773種類のヒトメタゲノムを獲得し、MetaProdigal [2]を利用して15 bp以上のORFを同定した上で50アミノ酸に相当する長さを超えるORFsを除く2,514,099 sORFsを得た。これらを翻訳したアミノ酸配列をCD-HIT解析したところ444,054種類のクラスターに分類された。この中で、Conserved Domain Database (CDD) に基づいて既知ドメインを割り当てることができたのは、わずかに2,225 (~0.5%)クラスタであった。
  • そこで、膨大なクラスターから、8種類以上のDNA配列を含む11,715クラスタについてRNAcodeによる解析を経て、タンパク質らしい (more likely to be protein-coding)4,539ファミリーへと絞り込んだ。このクラスタに属するsPROの91%にはリボソーム結合サイト (RBS)を帯びているが、CCDドメインを割り当てることができたのは190ファミリー (~4%)に止まった。また、4,539のsPROファミリーの代表配列のうち、RefSeqのバクテリアゲノム69,681種類においてタンパク質とアノテーションが付されている50アミノ酸以下と相同な配列は1,149件 (~25%)に止まった。RefSeqを著者らのパイプラインで再アノテーションした上でホモログを検索し直したが、2,164件 (~48%)にはホモログが存在しなかった。
転写と翻訳の裏付け
  • 226件の公開されているヒト糞便メタトランスクリプトームのデータセットと照合し、689のsPROファミリーについてホモログを見出し、そのうち518ファミリーに実際に転写されるホモログが少なくとも一つ存在することを見出した。
  • 続いて、2件の公開メタプロテオームのデータセットに、25種類のsPROファミリーを見出した。そのうち、Bacteroides thetaiotaomicronイタの35 sORFsに焦点を絞り、リボソームプロファイリング (Ribo-seq)から35 sORFsのうち14 sORFs (40%)が実際に翻訳され、質量分析プロテオミクスからは10%が翻訳されるとする結果を得た。
機能推定
  • バクテリアに限らず、ウイルス、アーケアおよび真核生物とのゲノム・メタゲノムの比較解析から、各sORF/sPROファミリーについて、翻訳や遺伝子発現調節などのハウスキーピング、タンパク質輸送、ファージ抵抗性、ストレス応答、薬剤抵抗性、クオラムセンシング、他のバクテリアに対する抗菌性などの機能を推定した。
参考文献
  1. In Search of Lost Small Peptides. Plaza S, Menschaert G, Payre F. Annu Rev Cell Dev Biol. 2017 Oct 6;33:391-416.
  2. Gene and translation initiation site prediction in metagenomic sequences. Hyatt D, LoCascio PF, Hauser LJ, Uberbacher EC. Bioinformatics. 2012 Sep 1;28(17):2223-30. Online 2012-07-12.

[出典] Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Cross KL, Campbell JH [..] Podar M. Nat Biotechnol. 2019-09-30.

背景
  • 長年にわたりヒトをはじめとする生物から土壌をはじめとする環境までに、膨大な種類の微生物が生息するとされていたが、その多様性が近年、シングルセル・ゲノミクスとメタゲノミクスによってデータ化されてきた。
  • 一方で、殆どの微生物種が分離培養困難なために、個々の微生物種の機能解析および全ゲノムシーケンシングは遅々として進んでいない。
  • Oak Ridge National Laboratoryを主とする研究グループは今回、逆遺伝学に則って、狙った微生物種を分離培養可能とする手法を開発した。
逆遺伝学に基づく分離培養法 (原論文Fig. 1参照)
  1. SAGs (single-cell amplified genomes)と MAGs (metagenome-assembled genomes)から膜タンパク質をコードする遺伝子を同定し、エピトープを選択し、ウサギからそのIgG抗体を得て、蛍光標識する。
  2. この蛍光IgG抗体を利用して、サンプルからFACSにより、標的微生物細胞を分離する。
  3. 標的微生物細胞の培養を、多様な液体培地および固形培地を試行し、最適な培地を選択あるいは作出する。
実証
  • 今回の標的は、環境由来の16S rRNA配列に基づいて'candidate phylum'の一種として定義されたCandidate division TM7 (Saccharibacteria)に属するヒト口腔細菌であり、口腔細菌の1%未満とされこれまで未培養であった。
  • 健常人と歯周炎患者からの唾液と歯肉下液から、3種類の菌株の分離と、嫌気性・低酸素条件の培の試行を経て純粋培養を実現し、シングルセル・シーケンシング解析などを経て、多様なアクチノバクテリアのエピビオント (epibionts)であることを同定した。
  • また、未培養分類群であったCandidate division SR1についてもヒト口腔細菌の分離純粋培養に成功した。
  • こうして、任意の環境から任意の微生物株を分離・純粋培養する道が拓けた。

[出典] "CRISPR-Cas System of a Prevalent Human Gut Bacterium Reveals Hyper-targeting against Phages in a Human Virome Catalog" Soto-Perez P, Bisanz JE, Berry JD, Lam KN, Bondy-Denomy J, Turnbaugh PJ. Cell Host & Microbe. 2019-09-03

 UCSFの研究グループは今回、ヒト腸内に豊富なバクテリオファージと腸内マイクロバイオームの間の相互作用を解明していく観点から、腸内バクテリア内在のCRISPR-Casシステムとヒトvirome (バイローム/ヒトウイルスメタゲノム)の解析に取り組んだ。
  • ヒト腸内に内在する放線菌の一種であるEggerthella lentaに注目し(*)、タイプI-C CRISPR-Casシステムが内在・転写され、外因性DNAと内因性DNAの双方を標的することを見出した。
  • E. lentacas遺伝子配列とスペーサの構成は菌株に依存して変動したが、これらのデータに基づいて、E. lentaのCRISPR-Casシステムが2種類に分類された。
  • プロトスペーサの探索を目的として、公開されている18件のvirome (バイローム/ウイルスメタゲノム)解析研究データに基づいて、9ヵ国730人に由来するサンプル1,831種類のデータセットからヒトvirome (バイローム/ウイルスメタゲノム)のデータベースHuVirDBを構築した。
  • HuVirDBはこれまでで最大規模であり、E. lentaのCRISPRアレイ内のスペーサの殆どに一致するウイルスDNA断片を含んでいた。
  • HuVirDBからまた、複数種類のE. lentaゲノムに内在するスペーサの標的を多重に帯びたウイルス"hyper-targeted"ウイルスが存在することが見えたきた。
  • (*) E. lentaはヒト腸マイクロバイオームに拡がっており (81.6%)、薬剤、食品由来生理活性物質から内在化合物まで代謝に広く影響を及ぼし、感染症と慢性疾患と相関している。

[出典] "Tumor Microbiome Diversity and Composition Influence Pancreatic Cancer Outcomes" Riquelme E, Zhang Y [..] McAllister F. Cell 2019-08-08;"Bacteria on tumors influences immune response and survival of patients with pancreatic cancer"MD Anderson Cancer Center News 2019-08-08

概要
 PDACと診断された患者の生存期間は5年未満とされているが、少数が長期間生存する。The University of Texas MD Anderson Cancer Centerを中心とする研究グループは今回、長期間生存者における腫瘍のマイクロバイオームと免疫システムの特徴を探った。
  • 16S rRNAシーケングに基づいて、短期生存期間の患者 (short-term survival: STS)と長期生存期間の患者 (long-term survival: LTS)の腫瘍マイクロバイオームの組成を比較解析した。
  • LTSの腫瘍マイクロバイオームのα多様性 (alpha diversity)がより多様であり、腫瘍内マイクロバイオームのLTSシグネチャー (signature)を同定した。すなわち、PseudoxanthomonasStreptomyces、ならびにSaccharopolysporaの3属とBacillus clausiiが、発見 (discovery)コホートと検証 (validation)コホートの双方において、長期生存の高精度な予後因子であった。
  • STS、LTSおよびコントロール (健常者)からモデルマウスへのFMT (fecal microbiota transplantation)それぞれが、モデルマウスにおける腫瘍マイクロバイオームと腫瘍の増殖および免疫細胞の腫瘍浸潤に、異なる影響を与えることを同定した。
  • 本研究により、PDACのマイクロバイオームの組成が、腸マイクロバイオームとクロストークし、宿主の免疫応答と切除手術後などの経過と相関することが示された。
背景
  • 腸マイクロバイオームの組成が癌免疫療法与える影響に関する知見が蓄積される中で、研究グループは、腫瘍内マイクロバイオームの作用に注目した。
  • 膵管腺癌は早期発見が困難であり、発見されてからの5年生存率は9%に過ぎない。早期に発見され外科手術後の再発率は高く生存期間中央値は24-30ヶ月に留まる。一方で、膵臓癌患者の中に長期生存者が少数存在するが、長期生存の指標となるゲノムバイオマーカーは未だ同定さていない。
腫瘍マイクロバイオームの特徴
  • 研究グループはMD Anderson (生存期間中央値10年22名と1.6年12名)のコホートを発見コホートとし、Johns Hopkins Hospital (生存期間中央値10年以10名と5年未満10名)のコホートを検証コホートとして、STSとLTSのPDACにおけるバクテリアDNAを比較した。
  • 16S rRNA配列でみると、LTSのマイクロバイオームがより多様であった。発見コホートをマイクロバイオームの多様性の高低で2群に層別化したところ、生存期間中央値がそれぞれ9.66年と1.66年になった。この傾向は、経験した療法、ボディマス指数 (BMI)、抗生物質の服用とは独立であり、多様性が外科手術後の生存期間予後因子になり得ることが示唆された。
  • 16sRNA配列が示す多様性の他に、マイクロバイオームの組成が大きく異なることも見出し、Pseudoxanthomonas, SaccharropolysporaおよびStreptomycesの3属、ならびに、Bacillus clausiiの1種が豊富なことが、発見コホートでも検証コホートでも生存期間の予後因子であることが示唆された。
  • また、両コホートにおいて、CD8陽性T細胞を含むT細胞の密度が高く、免疫細胞浸潤とT細胞の活性化と、3種類の属の比率が相関することも見出した。
腸マイクロバイオームと腫瘍マイクロバイオームならびに免疫応答との相関
  • 3名のPDAC切除患者について、PDACマイクロバイオーム、PDACに隣接する組織および腸マイクロバイオームを比較解析し、腸マイクロバイオームがPDACマイクロバイームの25%に見られたがその他の組織には見られず、腸マイクロバイオームが膵管に定着することが示唆された。
  • 進行性PDAC患者からFMTマウスでは、腫瘍マイクロバイオームの5%が移植した腸マイクロバイオームに相当したが、それ以外に腫瘍マイクロバイオームの70%が変動することを見出した。
  • 続いて、進行PDAC癌患者、LST (進行癌5年以上の生存者)および健常者から、腫瘍移植5週間後のマウスへのFMT実験を行なった。FMT後の腫瘍サイズが、LSTと健常者からのFMTでは進行PDAC癌患者からのFMTに対して、平均70%-50%減となった。
  • 膵臓癌モデルマウスに移植したところ、ドナーのマイクロバイオームはマウスモデル膵臓癌マイクロバイオームの5%を占めるに過ぎなかったが、移植によって、膵臓癌マイクロバイオームの70%が変動することを見出し、FMTによって、膵臓癌マイクロバイオームを改変可能なことが示唆された。
  • LSTからのFMTによって CD8陽性T細胞数と活性が向上し、続いて、T細胞を除去するとFMTの効用が消滅することを見出した。一方で、進行PDAC患者からのFMTは、制御性T細胞と骨髄由来免疫抑制細胞 (myeloid-derived suppressor cells: MDSCs)の増加をもたらした。

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