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[出典] Extracellular vesicles nanoarray technology: Immobilization of individual extracellular vesicles on nanopatterned polyethylene glycol-lipid conjugate brushes. Yokota S, Kuramochi H, Okubo K, Iwaya A, Tsuchiya S, Ichiki T. PLoS One. 2019-10-24;東京大学大学院工学系研究科プレスリリース 2019-10-29 "単一ナノ粒子計測を可能にするエクソソームアレイチップを世界で初めて開発~エクソソームの個性を調べる新たなプラットフォーム技術~" (crisp_bio注:本記事ではEVナノアレイという表記で統一したが、原論文では技術の多用性の観点からナノアレイ・チップと表記されている)

 細胞外小胞 (Extracellular vesicles, EV)は、由来する細胞の情報を帯びていることから、細胞間のコミュニケーションを担い、ひいては、リキッドバイオブシーのバイオマーカーや治療標的となり得ること、また、CRISPR/Cas9システムなどのキャリアとなり得ることから、その基礎研究と応用研究が急速に進展している [関連crisp_bio記事 1~8 参照]

 細胞外小胞は多様であり、サイズに応じて~35 nmのexomere、60~80 nmのエクソソーム-S (Exo-S)、90~120 nm のExo-Lといった分類が提案され [5]、サイズごとに自動的に分離するLab-on-A-Chip [7]も開発されてきたが、これまでの実験は、EV集団の平均像を捉えるに留まっていた。

 東京大学大学院工学研究科マテリアル工学の研究チームは今回、DNAマイクロアレイ製作技術の高精度化とマイクロ流体デバイスを組み合わせて、個々のEVを基板上のナノスポットに固定することに成功し、原子力間顕微鏡 (AFM)法によりEVの形状を分析することで、EVの由来細胞と、EVの変形能 (deformability)が相関することを示した。

 今回は、由来細胞依存変形能の同定が可能なことを実証したが、このEVナノアレイは、NGS、ELISA、SERS (表面増強ラマン散乱)、MALDI-TOFなどによるシングルEV-マルチオミックスのプラットフォームになり得る。
EVナノアレイの概念 (Fig. 1引用下図参照)1
  • PEG-脂質複合体で修飾したナノスポットを配置したシリコン基板を (上図 A)、マイクロ流体デバイスに組み込み、EVs懸濁液を流し、EVが、抗体を介さずに、PEG-脂質複合体を介してナノスポットに吸着することを期待する。
  • EVナノアレイをマイクロ流体デバイスから脱着したのち、AFMによりナノスポットに固定化されたEVsの形状を測定する (上図B)。
ナノスポットアレイの加工 (Fig. 2引用下図参照)2
  • 電子線リソグラフィー (Advantest F7000S-VD03システムを利用)を介してシリコン基板表面の二酸化ケイ素の層の上にナノスポットを形成し、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)を介してPEG-脂質で修飾する (上図A/D参照)。
  • ナノスポットの径、アレイのピッチそして密度はそれぞれ、200 nm、200 nmそして5.0 × 10,000 spots/mm2であり、ナノスポットへのEVsの付着は~100 nmの精度に及ぶ。
実証実験 (Fig. 3引用下図参照)3
  • ヒト乳がん細胞株 (Sk-Br-3)と、ヒト胎児腎細胞 (HEK293)由来のEVsを対象として、AFM画像から測定したアスペクト比 (aspect ration, AR)と直径 (d)から、ナノスポットの吸着前のEVsの直径Dを推定し、2種類の細胞の間で、Dの分布に有意差があることを見出した (上図 C/E参照)。
  • ナノスポット上での直径と高さがともに30 nmと7 nmを超える対象をEVsとして扱い、EVアレイの~20%に、EVsが吸着していることを見出した。
  • また、今回の直径 200 nmのナノスポットには、比較的小型のEVs (~ 30 nm ~ exomere)が選択的に吸着される傾向が見られ、今後、EVs懸濁液の流量、ナノスポットのサイズなどの実験条件と、検出ナノスポットのサイズおよび特性との相関関係の分析を進める必要がある。
[関連crisp_bio記事] 
1. CRISPRメモ_2018/03/08 [第2項] 細胞外小胞を利用したCRISPR-Cas9/sgRNAの新たな送達手段
6. CRISPRメモ_2018/02/07-2 [第9項] エクソソーム - リポソームのハイブリッド・ナノ粒子で、CRISPR/Cas9システムを間葉系幹細胞(MSCs)に導入

[出典] "A metabolic profile of all-cause mortality risk identified in an observational study of 44,168 individuals" Deelen J, Kettunen J […] Slagboom PE. Nat Commun. 2019-08-20

 長期死亡リスクの予測はこれまで、標準化が難しい臨床データに依存していたところ、Leiden University Medical CenterとUniversity of Ouluをはじめとするオランダ、フィンランド、独、英、エストニア、スイスならびにオーストラリアの研究グループは今回、大規模なコホートを対象として、 標準化されているハイスループットなNMRに基づくメタボローム解析を行い、心疾患や癌といった死因の如何によらない全死因死亡リスクの指標となる14種類の代謝産物を同定し、全死因死亡率の長期予測モデルを構築した。
  • 12コホートに由来する欧州系44,168人 (18~109歳)からの血液サンプルを対象として、226種類の代謝バイオマーカのメタ解析を行った。この中で、5,512名が追跡調査の期間内 (2.76~16.70年)に死去している (コホートの構成について原論文Table 1から引用した左下図参照)。
Table 1 Table 2
  • メタボロミクスから全死因死亡と有意に相関する136種類のバイオマーカを同定し、先行研究において全死因死亡と相関すると判定したバイオマーカを加えた159種類のバイオマーカの中から、互いに独立なバイオマーカ14種類へと絞り込んだ (このバイオマーカセットについて原論文Table 2から引用した右上図参照)。
  • 続いて、従来のバイオマーカのデータが最も揃っていたEstonian Biobankコホート (Table 1中のERF study)からのデータ (14種類のバイオマーカと性別)に基づく全死因死亡リスク予測モデル (重み付き危険因子スコア 原論文 Supplementary Table 4引用左下図)を構築し、FINRISK 1997コホート (7,603人; 追跡期間中に1,213人が死去)を対象とする予測を、収縮期血圧や総コレステロールなど従来の危険因子基づく予測と比較し、5年予測および10年予測ともに、より精度が高いことを示した (精度比較について原論文Fig. 1から引用した右下図参照)。
Table 2Fig. 1
  • 本モデルは、ハイスループットな NMRにより高齢患者に侵襲的療法が適切か否かといった臨床的判断の手がかりや、高齢者を対象とする臨床試験のサロゲートエンドポイントになり得る。

1. リキッドバイオプシーが投資家の関心を集めている
[出典] NEWS "Investors keep the faith in cancer liquid biopsies" Sheridan C. Nat Biotechnol. 2019-08-06.
  • 非侵襲的なリキッドバイオプシーによる癌の検知、癌療法の選択、療法に対する耐性発生や癌再発のモニターの可能性がアカデミアから発信されてきたが、臨床への展開はそれほど広がっていない。また、集団検診への展開も、極めて高いS/N比が要求されることから、簡単では無い。
  • 血中を循環する癌細胞由来のDNA (circulating tumor DNA: ctDNA)を検出するリキッドバイオプシーは、次世代シーケンシング (NGS)技術とともに現実になったが、臨床応用に十分な感度 (陽性と正しく判定する割合)と特異度 (陰性と正しく判定する割合)の実現は未だ課題である。
  • 一方で、企業におけるリキッドバイオプシー法の開発は激化しつつある。NEWSでは、参入企業が次々に数百億円の資金を調達しているエピソードから始まり、Table 1 SELECTER LIQUID BIOPSY TESTS FOR CANCER" に13社の製品、技術および進捗 (FDA承認など)をまとめ、本文中で、メチル化シグナチャー、CancerSEEK (crisp_bio 2018-01-19*)をはじめとするマルチオミックス、癌細胞由来DNAに加えて免疫細胞由来DNAの解析、AI、糞便DNAの利用などのアプローチが紹介している。また、学会発表から特異度99%/感度59-86%の性能も紹介している。
  • (*)2018-01-19 DNAとタンパク質の双方を標的とする"CancerSEEK"は、汎がんリキッドバイオプシーになり得るか
2. 欧州認可リキッドバイオプシー2種、KRASの低頻度変異検出結果に不整合
[出典] "Comparison of the Clinical Sensitivity of the Idylla Platform and the OncoBEAM RAS CRC Assay for KRAS Mutation Detection in Liquid Biopsy Samples" Vivancos A [..] Diaz-Rubio E. Sci Rep. 2019-06-20.
大腸癌の分子標的治療薬の一種である抗EGFR抗体薬は、効果があるKRASが野生型であることを判定した上で (KRASが変異していないことを確認した上で)、投与される。このため、KRAS変異アッセイを目的とするリキッドバイオプシー法が開発されている。
  • Vall d’Hebron Institute of Oncology (バルセロナ)のA. Vocancosらは、欧州でCEマークを獲得しているデジタルPCRに基づくSysmex Inostics社のOncoBEAMとリアルタイムPCRに基づくBiocartis社のIdyllaによるKRAS変異検出性能を、559人の転移性大腸癌患者由来のサンプルにより、比較評価した。
  • その結果、高頻度な変異について両者は一致するが、低頻度は変異では、OncoBEAMが高感度であるとした。MAF<5%とそのサブセットのMAF<1%の変異についてOncoBEAMが116サンプルと79サンプルを陽性と判定したのに対して、Idyllaはそのうち81サンプルと48サンプルについて陽性と判定するにとどまった。
  • # この報告に対して、抗EGFR抗体薬はMAF<1%のKRAS変異を帯びた大腸癌に対しては、野生型KRASを帯びた大腸癌と同等に奏功する例を挙げ、ラボでの感度判定と臨床での判定 (閾値)は必ずも一致しないというコメントが寄せられている (genomeweb 2019-08-02)。
3. 個別化血中循環腫瘍DNA解析により、癌ネオアジュバント療法後の遺残癌検出可能に
[出典] "Personalized circulating tumor DNA analysis to detect residual disease after neoadjuvant therapy in breast cancer" McDonald BR [..]  Pockaj BA, Murtaza M. Sci Transl Med. 2019-08-07. (bioRixv 2018-09-26).
  • 患者の血中に放出される腫瘍DNA (ctDNA)の解析は、腫瘍の存在の検出と治療標的となり得る変異を解析する非侵襲的手法として、期待される。しかし、極めて少量の腫瘍DNAを血中から検出することは簡単ではない。特に、化学療法を受けた患者の場合は特に難しい。
  • この課題に対して、Translational Genomics Research Institute, Mayo Clinicなどの研究グループは今回、患者ごとに最適化が可能であり、患者の経過を追跡して癌再発の早期発見を可能とする"targeted digital sequencing (TARDIS)"にて答えた。
  • ctDNA解析の標準試料において8種類から16種類の既知の変異を同時に解析することで変異アレルの割合 (allele fraction: AF)3/104と3/105それぞれについて、特異度96%で感度91%と53%を達成した。
  • 続いて、ステージIからIIIまでの乳癌の女性患者33名からの血漿サンプル80件について、患者あたり115種類までの変異をTARDISで解析し、AF中央値0.11%の患者全員についてctDNAを検出し、病理学的完全奏効 (pathCR)を見せた患者と遺残癌を伴う患者を比較すると、前者でネオアジュバント療法処置中にctDNAが顕著に減少し、ネオアジュバント処置終了後もctDNA濃度が有意に低いことを見出した。

[出典] "Genome-wide cell-free DNA fragmentation in patients with cancer" Cristiano S, Leal A, Phallen J, Fiksel J [..] Scharpf RB, Velculescu VE. Nature 2019-05-29;"Johns Hopkins Researchers Design New Blood Test That Uses DNA ‘Packaging’ Patterns to Detect Multiple Cancer Types" Johns Hopkins Medicine Newsroom 2019-05-29. (DELFIは' ‘DNA evaluation of fragments for early interception'に由来する)

 癌細胞から放出され血中を循環するセルフリーDNA 断片(cfDNA)は、癌の非侵襲的診断の手がかりとして有力である。米国Johns Hopkins University School of Medicineを中心とする米・オランダ・デンマークの研究グループは今回、超高感度な検出法を必要とする癌特有の変異に替えて、いわば癌特有の変異全体を見渡すことになる「ゲノム配列からみたcfDNAの断片化パターン」を捉えることで、癌の有無と、癌が存在する場合はその由来組織の同定を可能とするDELFI法 を開発した。
  • 208名の癌患者 (乳癌 54名、胆管癌 26名、大腸癌 27名、胃癌 27名、肺癌 12名、卵巣癌 28名および膵臓癌 34名;ステージ I, II, III, IV, X)と215名の健常者の血漿から抽出したcfDNAをシーケンシングし、ゲノム配列にマッピング、5-Mbpのウインドウサイズで、1ウインドウあたり >20,000のリード (reads)からそのウインドウでのcfDNAのサイズと量 (カバレージ)から、cfDNA断片化パターンを見てく(原論文 Fig. 1参照)。
  • 健常人のcfDNA断片化パターンは共通性が高く白血球のヌクレオソームDNAのパターンを反映していたが、癌患者のcfDNA断片化パターンは、血液細胞と腫瘍細胞のヌクレオソームDNA由来が混合し、健常人のそれと異なり、また、患者内で多様であった (原論文Fig. 3参照)。
  • 癌患者と健常者を判別する機械学習モデルは、Gradient Tree Boosting (勾配ブースティング回帰木)のアルゴリズムによった。
  • 癌検出の精度は、98%の特異度に対して、乳癌の57%から肺癌の100%と癌型によって異なった 。またステージでみると、同じく98%の特異度に対して、感度はステージIの68%からステージIVの77%、およびステージX (3名)の100%が得られた。
  • ROC曲線の下の面積 (Area Under the Curve: AUC)値で評価すると、変異DNA (mtDNA)準拠の0.72とコピー数準拠の0.88に対して、DELFIは0.94に達した (完全な分類だとAUC=1)。
  • DELFIの機械学習モデルは、全ケースの75%について、癌cfDNAが由来する組織同定を実現した。
  • DELFIに変異DNAのデータを加えると、癌の検出感度は91%へと向上した。
  • DELFIは、より短い断片の捕捉やPCRフリーのシーケンシングなどの技術改良を介してより高精度にしていくことが可能であり、また、より大きなコホートからのデータに基づく機械学習モデルの高精度化も期待できる。

[出典] "Hydro-Seq enables contamination-free high-throughput single-cell RNA-sequencing for circulating tumor cells" Cheng YH, Chen YC, Lin E [..] Yoon E. Nat Commun 2019-05-15.

 血中循環腫瘍細胞 (circulating tumor cells: CTCs)を一細胞分解能で分子解析する技術は、非侵襲性のリキッドバイオプシーに基づく癌の診断と治療を実現する。近年開発された多重並列scRNA-seqは、遺伝子発現とパスウエイ解析から細胞レベルの不均一性を解き明かす有力なツールである。しかし、血中には赤血球などの大量の血液細胞が存在しその中でCTCsは極めて微量であることから、全CTCsの全遺伝子を対象とする一細胞遺伝子発現プロファイリングは実現していない。

 University of Michiganの研究グループは今回、流体力学に基づいたCTCs選別とscRNA-seqバーコーディング技術を組み合わせて、CTCの一細胞レベルでのハイスループット・プロファイリングを実現するスケーラブルなHydro-seqを開発した。

 Hydro-seqが備えている「CTCsを高い効率で捕捉する機能」と「血液細胞によるコンタミネーションを除去する機能」によって、21名の転移性乳癌患者由来の666 CTCsのハイスループットscRNA-seq解析が実現した。
  • Hydro-seqでは~5時間程度でCTCsシーケンシングまでの前処理が完了する。
  • 血中循環細胞の~95%が血液細胞であり、CTCsはその5%であった。ER, PRおよびHER2を含む臨床バイオマーカ、癌幹細胞のバイオマーカ、および上皮間葉転換のバイオマーカを帯びた細胞を同定・追跡した (原論文Fig. 4引用下図左参照)。
Hydro-seq 4 Hydro-seq 5
  • 癌幹細胞 (cancer stem cells)はバイオプシーの場合はサンプルの1~5%程度であるがリキッドバオプシーのサンプルの場合は30-50%を占めた。
  • CTCsには、患者内不均一性が存在することが明示された (原論文Fig. 5引用上図右参照)
  • Hydro-seqによる一細胞トランスクリプトーム・プロファイリングは、分子標的療法や癌転移過程のモニタリングに有用である。
マイクロフルーイディックデバイス (原論文 FIg. 1引用下図参照)

 下図aにあるように、全体構造は、1デバイスあたあたり800チャンバーを、16本のチャネルに配置してある。各チャンバーに① Entrance valve、② Bead Valveおよび③ Cell Valveが備わっている。Valves (バルブ)の開閉によって、サンプル血液の取り入れとCTCsの選別、洗浄、バーコードを付したビーズと細胞の融合、細胞溶解、ビーズ回収などが制御される (下図 f~j)。バルブの②と③はスペース節約のため隣り合うチャンバーと共有され、いずれも高さ15μm/開口100x100μmと、チャンバーに流入した血液から赤血球などの血液細胞は通過し癌細胞はチャンバーに閉じ込められるように設計されている。Hydr-seq 1

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