タグ:免疫・療法

[出典] MAIT Cells Promote Tumor Initiation, Growth, and Metastases via Tumor MR1. Yan J [..] Teng MWL. Cancer Discovery. 2019-12-11
[関連crisp_bio記事] 2020-01-23 
ヒトMHCクラスⅠb 分子のMR1は、癌免疫療法の新たな標的 (2/2) - 汎ヒト・汎がん療法の可能性も

 進化的に保存されている (invariant)T細胞抗原受容体(TCR)α鎖 (Vα7.2-Jα33)を発現している細胞として同定されたMAIT (Mucosal associated invariant T)細胞は、ヒトMHCクラスⅠb 分子であるMR1 (major histocompatibility molecule related)によって活性化することが知られており、その病原体の感染や炎症への応答などが解明され、癌療法の観点からも注目を集めているが、これまでのところ、腫瘍の抑制と亢進それぞれを示唆するデータが得られ、議論が続いている [1-3]

 QIMR Berghofer Medical Research Institute, University of QueenslandならびにUniversity of Melbourneの研究グループは今回、ヒトMR1と相同のMr1をノックアウトした肺癌マウスin vivoでの実験において、MAIT細胞が癌の発生、成長および転移を亢進することを初めて明らかにした。
  • Mr1-/-マウスでは、野生型マウスに比べて、癌の発生、成長および転移が、有意に抑制された。
  • Mr1-/-マウスに見られた抗腫瘍性は、NK細胞そしてまたはCD8陽性T細胞およびIFNγに依存していた。
  • Mr1-/-マウスに、MAIT細胞を養子移植すると、転移抑制が解除された。
  • MR1分子を阻害する抗体投与によって癌の転移と成長が抑制された。
  • MR1リガンドを投与したマウスとヒトの癌細胞株において、全てではないが、MR1の発現亢進が見られた。
  • 癌細胞株に、刺激性 5-OP-RUリガンドまたは抑制性 Ac-6-FPリガンドを投与すると、それぞれ、転移が亢進または抑制された。
  • MR1を欠損させた癌細胞株は、親株に比べて転移が抑制された。
  • MAIT細胞によるNK細胞のエフェクター機能抑制は、腫瘍細胞のMR1に依存し、また、宿主のIL17Aにも一部依存した。
 MAIT細胞については、in vitroで癌細胞を殺傷するとする報告があったが、腫瘍微小環境において、細胞障害性の抗腫瘍(antitumor)エフェクターとして機能するか、あるいは、protumorに転向するのか、双方の報告が続いている[1-2]。今回、腫瘍細胞が発現するMR1に活性化されたMAIT細胞が、NK細胞そしてまたはCD8陽性T細胞のエフェクター機能を抑制し、腫瘍の発生、成長および転移を促進することが示された。したがって、MR1を発現している癌に対して、MR1の阻害 (すなわち、MAIT-MR1軸の阻害)による療法の可能性が示された。

[参考文献]
  1. Frontier in Immunology誌とFrontier in Oncology誌が"MAIT Cells in Cancer and How to Target them"をトピックとする投稿を募集中 (2020年2月12日締切)
  2. Tumor-infiltrating Mucosal-Associated Invariant T (MAIT) Cells Retain Expression of Cytotoxic Effector Molecules. Sundström P [..] Quiding-Järbrink M. Oncotarget. 2019-04-19
  3. Mucosal-Associated Invariant T Cells Display Diminished Effector Capacity in Oesophageal Adenocarcinoma. Melo AM [..] Dunne MR. Front Immunol. 2019-07-10
  4. The intracellular pathway for the presentation of vitamin B-related antigens by the antigen-presenting molecule MR1. McWilliam HE [..] McCluskey J, Rossjohn J, Villadangos JA. Nat Immunol. 2016-04-04

[論文] An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Jansen CS, Prokhnevska N [..] Kissick H. Nature 2019-12-11. [NEWS AND VIEWS] Identifying the source of tumour-infiltrating T cells. Kumar Vodnala S, Restifo NP. Nature 2019-12-11

 患者自身の免疫細胞を利活用する養子免疫細胞療法 (adoptive cell therapy, ACT)は、進行した血液癌や固形癌の患者に持続的な抗腫瘍性をもたらし、癌療法を革新した。しかし、ACTの恩恵は全ての患者には行き渡らない。細胞障害性T細胞の腫瘍組織への浸潤は、癌療法への応答ひいては生存期間と相関することが知られている。しかし、この浸潤は全ての患者と腫瘍組織に同じように起こるわけではない。Emory University School of MedicineとNational Cancer Instituteなどの研究グループは今回、細胞障害性CD8 陽性T細胞のヒト腫瘍への浸潤の機構解明に取り組んだ。
  • 切除手術を受けた腎臓癌患者68名に由来する腫瘍組織をフローサイトメトリーで分析し、CD8 T細胞浸潤が全細胞に占める割合が由来によって0.002%から>20%の間で分散しており、手術後の癌の進行が2.2%未満の患者において有意に速い (ハザード比 https://oncolo.jp/dictionary/hr 3.84)ことを見出した。CD8 T細胞浸性は癌の進行度や患者の年齢と相関しなかった。
  • 腫瘍浸潤T細胞集団は2つの細胞集団で構成されていた。一つは、TCF1を発現している幹細胞様CD8 T細胞とその子孫細胞の集団であった。もう一つは、それらと関連したクローンではあるが、増殖せず、抗原による再活性化に応答せず、PD-1をはじめとするチェックポイント分子を高発現している、いわゆる疲弊した、最終分化細胞集団であった。この疲弊した細胞集団の存在が、興味深いことに、腫瘍浸潤T細胞の総数と相関し、かつ、癌の進行抑制と相関していた。
  • 腎臓癌患者の腫瘍組織で発見したこの現象は、抗原との間で続く戦いの中で、チェックポイント分子が発現・蓄積し、T細胞が癌細胞に対する細胞障害性を失っていくモデル、疲弊モデル、と整合しない。研究グループは幹細胞様細胞と最終分化細胞の機能と、両者に見られたT細胞受容体 (TCRs)が有意に重なりあっていたことから、研究グループは、最終分化細胞が幹細胞様幹細胞から分化するモデルを提唱した。
  • このモデルの成立には、二次リンパ組織におけるT細胞領域に相当する領域の存在が、腫瘍組織に内在していることが前提となる。T細胞は、ニ次リンパ組織において抗原提示細胞と相互作用することで、抗原特異的な免疫応答活性を獲得する。研究グループは、腎臓癌に加えて、前立腺癌および膀胱癌の腫瘍組織に浸潤している抗原提示細胞 (APCs)集団を分析し、腫瘍組織において樹状細胞の存在と幹細胞様CD8 T細胞が有意に相関することを同定した。マクロファージの存在と幹細胞様CD8 T細胞数またはCD8 T細胞数とは相関しなかった。
  • APCsと幹細胞様CD8 T細胞の分布が相関することを、さら蛍光免疫染色法によって同定した。TCF1(+) CD8 T細胞が、MHC-II陽性の細胞が高密度 (5 細胞/10,000µm2)に存在する領域 (研究グループはimmune nicheと表記)に局在していたのに対して、TCF1(-) CD8 T細胞は、組織全体に分布しimmune nicheへの偏りは見られなかった。さらに、腎臓癌患者由来組織において、immune nichesの数と手術後の癌の進行抑制とが相関し、この相関は腫瘍細胞のPD-L1発現如何の影響を受けないことも、同定した。
  • こうして、immune niches発生機構の解明、腫瘍がimmune nichesの生成・持続を回避する機構の解明といった新たな課題が生まれた。
NEWS & VIEWS関連ツイートを以下に引用
癌免疫療法関連最近のcrisp_bio記事



[出典]
[概要]
 Regnase-1はT細胞の活性化を抑制する重要なタンパク質であり、 T細胞におけるRegnase-1の欠損と自己免疫疾患が相関することが報告されていた [下図はRegnase-1によるT細胞の活性化制御のモデル図 (植畑拓也・審良静男, 2003*]。図2
 今回、St Jude Children’s Research Hospitalを主とする研究グループは [**]、CRISPR-Cas9でRegnase-1を欠損させた細胞障害性CD8陽性T細胞集団の腫瘍組織への浸潤と蓄積および持続する抗腫瘍性 (stand the test of time)を、急性リンパ性白血病 (ALL)とメラノーマのマウスモデルで同定し、併用療法も含むCAR-T療法を強化する選択肢を広げた。
[*] Regnase-1Malt1により切断されT細胞の活性化を制御する. 植畑拓也・審良静男. ライフサイエンス新着論文レビュー (2003)
[**] プール型CRISPRスクリーン技術関連でBroad Instituteが参加

CRISPR-Cas9スクリーン
  • CAR-T療法をはじめとする養子T細胞療法 (adoptive T-cell therapy, ACT)は、細胞障害性CD8陽性T細胞の寿命と活性を必要とする。腫瘍微小環境におけるCD8陽性T細胞は、栄養とエネルギーを提供する安定した代謝反応を必要とすると想定されている (その分子機序は未解明)。そこで研究グループは、ACTモデルマウスを対象とする代謝に関連する遺伝子3,017種類を標的とするプール型sgRNAsライブラリーに基づくCRISPR-Cas9ノックアウト・スクリーンから始めた。すなわち、卵白アルブミン(Ova)を発現するB16メラノーマ細胞を播種したマウスに、Ovaを認識するOT-I 抗原受容体に加えてCas9とsgRNAsを発現させたCD8陽性T細胞 (CAR-T細胞)を導入するACTの系において、腫瘍浸潤リンパ球に見出されたCAR-T細胞のsgRNAsをカウントした。
  • プール型CRISPRスクリーンから、その欠損が腫瘍浸潤を亢進する遺伝子として、細胞生存を増殖の制御因子としてよく知られているTxnrd1Ldha, Fth1, およびFoxo1などを同定したが、スクリーンのトップヒットはREGNASE-1 をコードするZc3h12a (Regnase-1)であり、REGNASE-1欠損CAR-T細胞の腫瘍への浸潤・蓄積は、REGNASE-1を欠損していない野生型CAR-T細胞の~2,000倍に至った。REGNASE-1は、RNAに結合・分解し、本記事冒頭にもあるように免疫応答に関与することが知られているが、CD8陽性T細胞の抗腫瘍性への関与は知られていなかった。
REGNASE-1欠損 CD8陽性T細胞(以下、R欠損型細胞)の特徴
  • R欠損型細胞は、メラノーマ・モデルに加えて急性リンパ性白血病 (ALL)モデルでも、持続する抗腫瘍性を発揮した。
  • R欠損型細胞の増殖速度は野生型細胞と同程度であったが、寿命が長く、その結果、蓄積が進んだ。
  • R欠損型細胞と野生型細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、前者のプロファイルにはメモリーT細胞のシグナチャーが顕著であた。これは、R欠損型細胞の場合、長寿命のメモリーT細胞がより多く存在し、細胞障害性CD8T細胞がそこから再生されることが示唆された。また、R欠損型細胞ではミトコンドリアの活性を担う遺伝子が顕著に高発現していた。
  • R欠損型細胞におけるCRISPR-Cas9による~20,000遺伝子を標的とするゲノムワイドスクリーンから、CD8陽性T細胞の分化を制御する転写因子BATFが、R欠損型細胞の長寿化とミトコンドリア活性化に貢献することが示唆された。
  • また、REGENASE-1に加えてPTPN2または SOCS1を同時に欠損させると、寿命、蓄積および抗腫瘍性に相乗効果がもたらされた。
  • R欠損型細胞は、細胞障害性CD8陽性細胞だけでなくメモリー様 (memory-like)T細胞も、野生型細胞よりも高いレベルの細胞障害性因子を発現した。
CAR-T療法・併用療法の可能性
  • CAR-T療法におけるT細胞ex vivo改変の際にREGNASE-1をノックアウトまたは発現抑制の改変を加える。
  • PTPN2またはSOCS1阻害剤を併用する。
関連ツイート引用

[出典] [NEWS & VIEWS] Three is a charm for an antibody to fight cancer/Trispecific antibodies offer a third way forward for anticancer immunotherapy. Garfall AL, June CH. Nature. 2019-11-21.; [論文] Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation. Wu L, Seung E [..] Yang Z, Nabel GJ. Nature Cancer. 2019-11-18.
[crisp_bio注] 本記事は主として NEWS &VIEWS に準拠
概要
 HIVに対する三重特異性 (trispecific)抗体を2017年に発表した (Science, 2017 )サノフィは今回、骨髄腫細胞表面に発現するCD38抗原、T細胞表面に発現するCD28抗原とCD3タンパク質複合体の3種類の分子を標的とする三重特異性抗体 (以下、CD38/CD3×CD28抗体)を開発し、効果的な抗腫瘍性を発揮することを、Nature Cancer誌に発表した

背景と詳細

[一重特異性抗体 (モノクローナル抗体)]
 モノクローナル抗体医薬品は多数認可され、多発性骨髄腫に対しても、CD38抗原を標的とするダラツムマブ/Daratumumab (商品名 ダラザレックス)が再発または難治性および未治療患者への適用を認可されている。なお、CD38は、急性リンパ性白血病や急性骨髄性白血病などの癌細胞にも発現している。

[二重特異性抗体]
 二重特異性抗体は、通常、癌細胞表面抗原CD3タンパク質複合体を標的とする。CD3はT細胞受容体 (TCR)の一部であり、TCRは、抗原認識ドメインを帯び、抗原に結合することで、活性化シグナルをT細胞内へ伝える。こうして、二重特異性抗体は、T細胞に内在している抗原特異性とは独立に、T細胞を癌細胞に近接させつつ、T細胞の抗腫瘍性を発揮させる。
 癌細胞のCD19とCD3を標的とする二重特性抗体のブリナツモマブ (商品名 ビーリンサイト )は、進行したB細胞急性リンパ芽球性白血病 (B-ALL)患者の寛解率と生存率を向上し、B-ALLの初期治療の治験が進んでいる (Blood, 2018)。

[CD38/CD3×CD28抗体]
 CD38/CD3×CD28抗体は、CD38とCD3に加えて共刺激受容体の一種であるCD28を標的に加えた。T細胞はTCRを介して標的抗原を認識し、共刺激受容体の補助を得て、免疫応答に効果的な増幅を持続する。共刺激の機序が存在しないと、TCRを介して長期間抗原に暴露されたT細胞はanergy (アネルギー)またはexhasution (疲弊)と呼ばれる免疫不応答の状態に陥り、アポトーシスに至る。
 共刺激受容体をT細胞の活性化に利用する戦略は、癌細胞に発現している抗原と共に、CD3やCD28といったT細胞活性化ドメインも認識するように改変したキメラ抗原受容体を備えたT細胞 (CAR-T細胞)による癌免疫療法に生かされている。しかし、多発性骨髄腫に対する完全長B-Cell Maturation Antigen(BCMA)を標的とするCAR-T療法の効果は短期的である (NEJM, 2019)ことから、新たな療法が求められている。
 CD38/CD3×CD28抗体がCD28を標的とした効用は、T細胞活性化に加えて、骨髄腫細胞への結合親和性の向上もある。CD28は多発性骨髄腫細胞で高頻度に発現していることが知られていたが、今回、CD38とCD28の発現レベルが異なる3種類の多発性骨髄腫細胞での検証実験から、CD28が三重特異性抗体の骨髄腫細胞への結合親和性を高め、CD38の発現が弱い骨髄腫細胞に対する効果を高めることを同定した。

[CD38/CD3×CD28抗体の効用]
 ヒトT細胞とヒト骨髄腫細胞を帯びたヒト化モデルマウスにおいて、3種類の分子を標的とする3種類のドメインを変異させた(*)CD38/CD3×CD28抗体の効果を比較し、CD28を標的とするドメインの存在によって、T細胞の活性と増殖、および抗アポトーシス性タンパク質Bcl-xLの発現が亢進することを同定した。
 また、in vitroにて、CD28を標的とするドメインを帯びたCD38/CD3×CD28抗体が骨髄腫細胞株を効果的に細胞死へと誘導することも確認した。また、CRISPR-Cas9を介してCD28をノックアウトしたKMS-11細胞 (KMS-11 KO細胞) のCD38/CD3×CD28抗体による溶解性が、元のKMS-11細胞の10~100分の1に低下することも同定した。

[CD38/CD3×CD28抗体の構造] 
 2つの三重特異性抗体がT細胞表面に沿って、T細胞表面上でダイマーを形成している各CD28にそれぞれ結合することを同定した (原論文 Fig. 6参照):6O89 Anti-CD28xCD3 CODV Fab (分解能 2.09 Å); 6O8D Anti-CD28xCD3 CODV Fab bound to CD28  (分解能 3.547 Å)

[CD38/CD3×CD28抗体の課題]
 免疫システムの活性化に伴うリスクであるサイトカイン放出症候群について、研究グループは、サルを対象として、皮下注射によって静脈注射の場合よりも緩和されると報告したが、サルでの結果がヒトに外挿できるか検証が必要である。また、CD38/CD3×CD28抗体の分解をもたらす抗体自身に対するヒトの免疫応答についての検証も必要である。

[出典] Highly efficient multiplex human T cell engineering without double-strand breaks using Cas9 base editors. Webber BR, Lonetree C [..] Moriarity BS. Nat Commun. 2019-11-19. (bioRxiv. 2018-11-29)

概要
 University of Minnesotaの研究グループは先行研究 [1]で、CRISPR/Cas9システムを利用することでヒト初代B細胞におけるノックアウト、ノックインおよび転座誘導を実現していたところ今回は、BE (base editor)を利用することで、ヒト初代T細胞において、転座の発生を抑制しつつ、多重遺伝子編集を実現した。

成果
 ゲノム工学と養子免疫細胞療法 (adoptive cellular therapy)の融合は、遺伝子疾患と癌に対する効果的な療法をもたらす可能性を秘めている。特に、複数の遺伝子の編集は、療法の効能の強化と適用範囲の拡大をもたらすが、意図しないゲノム改変と遺伝毒性を伴うリスクを秘めている。
 研究グループは今回BEを利用することで、アロジェニックな (他家移植型)CAR-Tプラットフォームの基盤となるヒト初代T細胞の複数の遺伝子の多重編集を、二本鎖DNA切断 (DSB)を最小限に留めつつ効率よく実現可能なことを示した 。
 BEによる多重遺伝子編集は、CD19特異的CAT-T細胞の効力を高めると共に、T細胞の増殖性を高め、一方で、多重遺伝子編集にCas9ヌクレアーゼを使用した場合に発生するDSBを介した転座を誘導しなかった。

詳細
 BEはこれまで、未成熟ストップ (premature stop: pmSTOP)コドンの誘導 [2] を介して遺伝子ノックアウトと、スプライス受容(Splice Acceptor: SA)部位の消失を介したエクソンスキッピング [3] に、利用されてきた。研究グループは今回、遺伝子ノックアウトには、スプライス供与 (Splice Donor: SD)部位を含むスプライス部位の消失がpmSTOP誘導に優る点を指摘した (下図のBEによるスプライト部位におけるC-to-T変換の模式図参照 - 原論文 Supplementary Figure 1から引用)。Suppl. Fig. 1
 CBEによるpmSTOP誘導には、STOPコドンのリードスルー (readthrough)が遺伝子によっては30%程度発生し、細胞ストレス下ではそれがさらに亢進し、加えて、改良されてきたCBE (C-to-T変換) [4]でも、C-to-G/Aの誤変換が25%程度発生することからpmSTOPの誘導が実現しないことから、タンパク質ノックアウトの効率が上がらず、また、望ましくないアミノ酸置換に至るリスクが存在する。
 研究グループは、PD1/PDCD1 (programmed cell death 1)、TRAC (T cell receptor α constant)ならびにB2M (β-2 microglobulin)を標的として、pmSTOPs誘導またはSDおよびSAの配列改変を目的とする一連のsgRNAsを用意し、BE3またはBE4のmRNAとともに、T細胞へエレクトロポレーションし、サンガーシーケンシングおよび研究グループで開発していたEditR [5] によりC-to-T変換率のsgRNAs依存性 (SD, SAまたはpmSTOPと標的位置への依存性)を比較し、加えて、タンパク質ノックアウト率も比較し、C-to- (AまたはG)変換率についてもBE3とBE4の間で比較した (原論文 Fig. 1引用下図参照)。Fig. 1
 多重遺伝子編集を、各遺伝子に対して最も効果的なsgRNAとBE3またはBE4の送達により試行したところ、各遺伝子のノックアウト効率が著しく低下したが、コドン最適化したBE4 (coBE4)により、SpCas9を凌ぐタンパク質ノックアウト効率~90%を達成した。また、タンパク質3種類のノックアウト率が、coBE4 mRNAの1.5 µgと4 µg投与によりそれぞれ86.6 ± 3.75%と89.57 ± 4.2%に達した。
 最後に、CD19 CARを形質導入したcoBE4ノックアウトT細胞は、サイトカイン、IL-2、TNFαならびにIFNγを安定して産生し、PD-L1を過剰発現させたRaji細胞を殺傷することを、確認した。

[参考crisp_bio記事]
  1. 2018-08-15 CRISPR/Cas9によるヒト初代B細胞ゲノム工学
  2. 2019-09-12 iSTOP:BE3に依るSTOPコドン誘導で遺伝子編集
  3. 2019-11-23 CRISPR-SKIP:ABEを分割することでAAV送達を実現し、in vivoエクソンスキッピング療法へと向かう
  4. 2017-09-05 塩基編集法(BE)第4世代へ:BE1, BE2, BE3からBE4へCRISPRメモ_2018/05/30 - 3 [第1項] 塩基エディターBE4とABEを、BE4max/AncBE4max/ABEmaxへと強化;CRISPRメモ_2018/07/07 [第2項] BE (Base Editors)をさらに強化
  5. EditR: A Method to Quantify Base Editing from Sanger Sequencing. Kluesner MG, Nedveck DA [..] Moriarity BS. CRISPR J. 2018 Jun;1:239-250

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