タグ:合成生物学

[出典] Extensive Mammalian Germline Genome Engineering. Yue Y, Kan Y, Xu W, Zhao HY, Zhou X, Song X [..]  Qin W, Gao Y, Wei H, Church GM, Yang L. bioRixv. 2019-12-19/20.  

 ブタの臓器による移植医療を実現するためには、ブタ内在性レトロウイルス (PERVs)の感染リスクと、移植片拒絶反応のリスクを回避する手立てが必要である。
 eGenesis、Harvard U、雲南農業大学などの米中およびデンマークの研究グループは先行研究で、CRISPR-Cas9を介してPERVエレメントの25コピーすべてをノックアウト(以下、PERVKO)し、PERVフリーなブタを樹立していた [*]
 今回、eGenesis, Harvard U、雲南農業大学、Qihan Bio (杭州市)などの米中の研究グループは、ヒトにとっての異種抗原にあたる3因子(GGTA1, CMAH, B4GALNT2)のノックアウトと9種類のヒト遺伝子(transgenes)ノックインを加えた3KO 9TGブタを樹立し、続いて、PERVsを全てノックアウトすることで、PERVKO 3KO 9TGブタの樹立に成功し、ブタ臓器による移植医療の実現にまた一歩近づくとともに、合成生物学の可能性を示した。
  • ブタの耳の線維芽細胞に、3因子の遺伝子を標的とするCRISP-Cas9システムと、PiggyBacトランスポザーゼと9種類のヒト遺伝子 (hCD46, hCD55, hCD59, hB2M, hHLA-E, hCD47, hTHBD, hTFPI, およびhCD39) を帯びたプラスミドを、それぞれエレクトロポレーションした。その結果から、3KO 9TGが実現したクローンを選択・増殖し、体細胞核移植 (SCNT)を経て、3KO 9TGブタを樹立した。
  • 次に、3KO 9TGブタ線維芽細胞に、PERVエレメント25コピーに共通な逆転写酵素pol遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9システムをエレクトロポレーションし、pol遺伝子に活性部位を含む大規模な欠損が生じたクローンを選択しSCNTを経て、PERVKO 3KO 9TGブタを樹立した。
  • オフターゲット編集については、野生型、3KO·9TGおよび PERVKO 3KO 9TGの耳の線維芽細胞において、10x WGSで検証した。オフターゲット変異誘導が2~3ヶ所に見られたが、タンパク質コーディングには影響を与えない変異であり、また、構造多型も見られず、PERVKO 3KO 9TGのゲノム安定性が確かめられた。
  • 設計通りのノックアウトとノックインが達成されたことを、RNA-seqによる遺伝子発現プロファイルとタンパク質発現プロファイルにより検証した。
  • PERVKO 3KO 9TGブタの生理機能は正常で繁殖性を備え、改変したゲノムは継代された。
  • In vitroアッセイにて、PERVKO 3KO 9TGブタ組織が、ヒトの液性と細胞性の免疫反応、および、調節不全凝固から免れることも見出した。
関連crisp_bio記事

[出典] PERSIST: A programmable RNA regulation platform using CRISPR endoRNases. DiAndreth B [..] Weiss R. bioRxiv. 2019-12-16
 導入遺伝子の発現調節は、遺伝子治療、細胞療法およびバイオマニュファクチャリングに不可欠な技術であるが、転写因子を介した調節は、エピジェネティックな遺伝子サイレンシングなどの複雑な分子機序に左右され安定性と信頼性に欠ける。MITの研究グループは今回、RNAレベルでの遺伝子発現のオンオフを可能とするプラットフォーム、PERSIST ("Programmable Endonucleolytic Scission-Induced Stability Tuning")、を開発することで、エピジェネティックな遺伝子サイレンシングに左右されない安定な遺伝子発現調節を実現し、bioRxivに投稿した。
  • PERSISTは、転写物の3'UTRと5'UTRにそれぞれ活性化用と抑制用のモチーフを組み込んだON-スイッチとOFF-スイッチを基本部品として、転写終了後の段階でのRNA切断を介した遺伝子発現調節を実現している。
  • PERSISTTプラットフォームは、CRISPRシステム由来のエンドリボヌクレアーゼ (endoRNases)、リボザイムおよびmiRNAsで制御可能である (HEK293FT、CHO-K1、HeLaおよびJurkatの各細胞株で検証)。
  • CRISPRシステム由来のendoRNasesとして、Cas6ファミリー由来のCsy4, Cse3 (TthCas6e), CasE(EcoCas6e)ならびにCas6 (PfuCas6-1)と、Cas13ファミリー由来のLwaCas13a,PspCas13b, PguCas13b, RanCas13bならびにRfxCas13dの9種類を検証・利用した。
  • CRISPR endoRNasesに基づくPERSISTによる遺伝子発現の抑制と亢進のダイナミックレンジはそれぞれ~100倍と~10倍であった。
  • CRISPR endoRNasesに基づくスイッチングの直交性とモジュラリティーおよびON/OFFのいずれもが可能 [*]な特徴を活かして、HEK293FTに、多段階カスケード、2入力ブール論理演算16種類、ポジティブフィードバック、フィードフォワード・ループ、および、ポジティブフィードバックとリプレッション・モチーフを組み泡あせた双安定性トグルスイッチを、構築した。
  • [*] 転写因子による調節の場合は、転写因子によってONかOFFかどちらか一方の選択を迫られるが、PERSISTでは、UTRに組み込むモチーフとの組み合わせにより同一のendoRNasesでONとOFFを同時に制御可能。

 無生物にその設計図や履歴をコードしたDNAを埋め込む‘DNA-of-things’DoT
[出典] A DNA-of-things storage architecture to create materials with embedded memory. Koch J [..] Erlich Y, Grass RN. Nat Biotechnol. 2019-12-09
 今回のNature Biotechnology論文の共同責任著者はそれぞれ、DNAストレージがこれまでの磁気テープや固定ディスクといったデータストレージの物理的限界を超えて、超高密度で超大容量 (215ペタバイト/g)のストレージとして利用可能であり [1]、また、加速劣化試験によって超長期間 (~2,000年)安定なストレージであることを示した [2]二つの論文の筆頭著者Yaniv Erlich (当時NY Genome Center/Columbia U, 現 Erlich Lab LLC)とRobert N. Grass (ETH Zurich)である。
 表題にある‘DNA-of-things’ (DoT)は、インターネットを介して物や事象 (things)同士が繋がる世界を意味する'Internet of Things' (IoT)になぞらえた表現であり、データを書き込んだDNAをナノメーターのサイズのシリカ・ビーズに埋め込み [*]、そのビーズをさまざまな材料に融合することで、具現化された  ( [*] silica particle-encapsulated DNA (SPED)ビーズ]。DoTはこうして、記憶装置としての性能に加えて、自在な形をとることができるという、これまでのストレージには決して無い特徴を備えるに至った。
  • Stanford Bunny [**]光造形用バイナリーデータ (STLファイルフォーマット)100 kbを45 kbに圧縮した上でDNA Fountain [1]により145 ntの長さのDNAオリゴに書き込んだ上で増幅しSPEDビーズに格納した。そのSPEDビーズを生分解性熱可塑性ポリエステルの一種であるポリカプロラクトン(PCL)溶解液と混合し、DNAに書き込んだと同じデータに基づいて3DプリンターによりStanford Bunnyを造形した。
  • 続いて、こうして造形したStanford Bunnyのごく一部 (~10 mg)に由来するSPEDからDNAを抽出してデータを読み出し、そのデータに基づいて3Dプリンターで造形することを繰り返した。1回の操作で、オリジナルのDNAオリゴの5.9%が失われたが、造形データに損傷は見られず、 操作を5回繰り返した後でも、オリジナルの造形データからの劣化は生じなかった。また、9ヶ月の間隔を開けた後の操作でも造形データの劣化は見られなかった。([**] スタンフォード大学にて3Dスキャナー で作成されたウサギモデル; Stanford Computer Graphics LaboratoryのThe Stanford 3D Scanning Repository Webサイトから2019-12-15にキャプチャした下図参照)Stanfod bunny
  • Stanford Bunnyの他に、2分間のビデオのデータ14MBを104 ntのDNAオリゴ300,000本に書き込み、SPEDビーズに融合し、メタクリル酸メチルに混合し、プレキシガラスへと重合化したのち、実用になるメガネレンズに加工した。このレンズから~10 mgの切片を切り出し、Stanford Bunnyの場合と同様にSPEDビーズそしてDNAを抽出しDNA Fountainを介してデータを読み出すことで、ビデオの再生を実現した。この例は、DoTを利用して、日用品の中にデータを隠すこと (ステガノグラフィー)が可能なことを示唆している。
  • DoTストレージは、建築材料や電子材料への品質管理用データの埋め込みや、医療インプラント材料への電子カルテのデータを埋め込みへと、展開可能である。
  • さらに、DoTストレージは、自己複製デバイス開発のツールにもなり得る。
[DNA記憶装置関連論文とレビュー]
  1. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Erlich Y, Zielinski D. Science. 2017-03-03.
  2. Robust chemical preservation of digital information on DNA in silica with error-correcting codes. Grass RN, Heckel R, Puddu M, Paunescu D, Stark WJ. Angew Chem Int Ed Engl. 2015-02-04
  3. [PROTOCOL] Reading and writing digital data in DNA. Meiser LC, Antkowiak PL, Koch J, Chen WD, Kohll AX, Stark WJ, Heckel R, Grass RN. Nat Protoc. 2019-11-20.
  4. [REVIEW] Molecular digital data storage using DNA. Ceze L, Nivala J, Strauss K. Nature. 2019-05-08
[Nature Researchのツイートを以下に引用]

[出典] Immediate, multiplexed and sequential genome engineering facilitated by CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae. Li ZH [..] Liu M, Wang FQ, Wei DZ. 
J Ind Microbiol Biotechnol. 2019-11-25. 
 華東理工大学に新合新生物医药集团 (Hunan Norchem Pharmaceutical Co., Ltd)が加わった研究グループが今回開発したCas-3Pは、Cas9を発現するプラスミド (pCas9)一種類と、gRNA発現を担う異なる選択マーカ付き直鎖状のプラスミドバックボーン3種類 (P1, P2およびP3)を組み合わせることで、S. cerevisiaeにおいて、多重かつ連続した遺伝子ターゲッティングを実現した。
  • P1/P2/P3のセットには遺伝子ターゲッティングを終えたプラスミドを除去する仕組みを予め組み込んでおく。すなわち、P1, P2およびP3には、プラスミド除去の標的になる部位 (CS1, CS2およびCS3)を組み込み、同時に、それらを標的とするgRNA_CS1、gRNA_CS2およびgRNA_CS3を、P2、P3およびP1に組み込んでおく。
  • こうすることで、Cas9を予め発現させた細胞に、異なるgRNAとドナーDNAのカセットを順次3種類のプラスミドバックボーンと共にP1 -> P2 -> P3の順に送達するサイクルを経て、gRNAを帯びたプラスミドの構築やgRNAプラスミドの除去操作を繰り返すことなく、多重な遺伝子ターゲッティングを連続させていくことが可能になった。
  • Cas-3Pの実証実験の中では、α-ガラクトシダーゼ遺伝子の挿入とβ-カロテン合成経路構築を実現し、さらに、パチョロールの生産最適化を、プロモータの置換、3種類の遺伝子の過剰発現および4遺伝子のノックアウトにより実現した。
  • Cas-3Pによる単一、二重および三重の遺伝子ターゲッティングの効率はそれぞれ3〜4日間で75%, 36.8%および8.2%に達し、パチョロールの生産最適化は10日以内で達成された。
  • 以上、Cas-3PはS. cerevisiaeのセルファクトリ化を促進するツールである。

出典
  • [論文] Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2. Gleizer S [..] Milo R. Cell. 2019-11-27.
  • [PREVIEW] Escherichia coli in Auto(trophic) Mode. Erb TJ, 0Keller P, Vorholt JA. Cell. 2019-11-27
  • [NEWS] E. coli bacteria engineered to eat carbon dioxide. Callaway E. Nature. 2019-11-27
  • [crisp_bio追記 2019-12-17] 酵母もオートトロフ化されたThe industrial yeast Pichia pastoris is converted from a heterotroph into an autotroph capable of growth on CO2. Gassler T [..]  Mattanovich  D, Steiger MG. Nat Biotechnol. 2019-12-16
炭素循環 [本項は原論文には詳述されていないcrisp_bio挿入分]
  • 気象庁のWebページ「二酸化炭素濃度の経年変化」によると、大気中の二酸化炭素量は、工業化 (1750年)以前の平均値とされる278 ppm (0.0278%)から2018年に世界平均で407.8 ppm (~0.0408%)へと47%増加し、また、気象庁が綾里、南鳥島及び与那国島にて測定したデータでも2019年に0.041%を超えた。
  • 地球温暖化説に対して賛否あり、大気中の二酸化炭素量が「3~4 % を超えると頭痛・めまい・吐き気などを催し、7 % を超えると炭酸ガスナルコーシスのため数分で意識を失う」に到るには進化的時間スケールを要すると思われるが、といって、二酸化炭素量の継続的上昇を放置して良いものでも無い。
  • 地球規模の人口増 (1975年 ~41億人; 2018年 ~76億人)と工業化の広がりを経ても濃度~0.04%に止まっているのは、大気圏内の炭素循環が回っているからである。この炭素循環を維持するには、人工的な二酸化炭素産生を抑制し、大気中の二酸化炭素を人工的に固定し分解あるいは変換を、促進することが必要である。
  • 生物界は、数億年の進化を経て、二酸化炭素を栄養源としてエネルギーや食糧の資源となるバイオマスに変換するオートトロフ (autotrophs: 独立/無機・栄養生物)と、有機化合物を栄養源とするヘテロトロフ (heterotrophs: 従属/有機・栄養生物)に、大別されるに至った。そこで、大気中の二酸化炭素量を制御する戦略の一つとして、植物、光合成細菌、化学合成細菌などのオートトロフ生物資源の保護・拡充が挙げられる。
研究成果
 二酸化炭素排出抑制も熱帯雨林の保護もままならぬ中、Weizmann Institute of Scienceの研究グループは今回、in silico解析から始まり遺伝子工学に進化工学を組み合わせることで、糖と多炭素化合物を栄養とするヘテロトロフ微生物である大腸菌を、二酸化炭素を唯一の栄養源としてバイオマス(*)を産生するオートトロフ微生物へと転換し、大腸菌を介して二酸化炭素をバイオマスへと変換する戦略の可能性を示した (* 2006年に閣議決定された「バイオマス・ニッポン総合戦略 」では、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」と定義されている)
  • 研究グループは、光合成反応における代表的な炭酸固定反応であるカルビン・ベンソン回路  (Calvin-Benson-Bassham, CBB)に替わり二酸化炭素を固定することを目的として、二酸化炭素から電気化学的に合成可能なギ酸塩 (formate; メタン酸塩)酸化モジュールの組み込みを試みた (モデル図として原論文Figure 1引用下図参照)。Fig. 1
  • 化学量論的in silico解析では、、メチル栄養細菌Pseudomonas sp. 101由来のNAD+に共役するギ酸デヒドロゲナーゼ (formate dehydrogenase, FDH)、CBB回路において二酸化炭素を固定化する酵素であるRubisCO、およびホスホリブロキナーゼ (Prk)の3種類の酵素を組み込むことで、大腸菌のオートトロフ化が進むとされたが、3酵素を組み込んだだけでは、大腸菌はオートトロフ化しなかった。
  • [本段落について、原論文Figure 2引用下図参照] FIg. 2
    そこで、 はじめに、解糖系のホスホフルクトキナーゼ (Pfk)と酸化的ペントースリン酸経路のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (Zwf)をノックアウトすることで、大腸菌がキシロース培地にてRubisCOを介したキシロースのカルボキシル化に依存して増殖するように設定した。次に、外因性のRubisCO、Prk、二酸化炭素を重炭酸塩を相互変換する炭酸脱水酵素(carbonate dehydratase, CA) 、およびFDHを発現させた。続いて、キシロースを制限しつつ、過剰なギ酸塩と二酸化炭素を10%含む空気を供給するケモスタットで培養を続けた。その結果、ケモスタットでの培養~200日 (~150世代に相当)で、キシロースを含まない培地での生育を観察し、~350日で全ての菌株がキシロース非依存/二酸化炭素依存になることを見出した。こうして、二酸化炭素を唯一の炭素源とし、FDHを介したギ酸塩の酸化をエネルギー源とする大腸菌株を得た
  • 研究グループは、ケモスタット由来の数クローンのゲノム解析から、指向性進化の過程で変異した遺伝子として、CBB関連遺伝子 5種類 (Category 1)、実験室内での大腸菌指向性進化実験で変異がよく見られる遺伝子 6種類 (Category 2)、および、クローンに依存して変動し機能未知の遺伝子 2~27種類 (Category 3)を同定した(原論文Figure 4引用下図参照)。FIg. 2

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