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[出典] Genome-scale CRISPR knockout screen identifies TIGAR as a modifier of PARP inhibitor sensitivity. Fang P, De Souza C, Minn K, Chien J. Commun Biol. 2019-09-09.

 PARP阻害剤は、相同組み換え (HR)機構を欠損 (“BRCAness”)している癌細胞に奏功する。J. Chien (UC Davis)の研究チームは、ヒト卵巣癌由来A2780細胞を対象として、PARP阻害剤オラパリブに対する感受性を指標とするGeCKOライブラリに基づくゲノムスケールCRISPR-Cas9機能喪失スクリーンの結果 (原論文FIG. 1引用下図参照)、TP-53で誘導される解糖系とアポトーシスの調節因子(TP-53-induced Glycolysis and Apoptosis Regulator: TIGAR)をコードするC12orf5の欠損が、A2780細胞のオラパリブに対する感受性を高めることを見出した。スクリーンショット 2019-09-11 14.45.59
 研究チームはまた、siRNAによるTIGARノックダウン (KD)実験から、TIGAR KDが癌細胞のオラパリブに対する感受性を高める分子機序と癌細胞の増殖を阻害する分子機序を明らかにした:TIGAR KDは、「ペントースリン酸経路の阻害 -> 細胞内ROS増加 -> オラパリブによるDNA損傷亢進」の機序とBRCA1とファンコニ貧血経路の下方制御を介して、“BRCAness”を機能的に誘導し、癌細胞のオパラリブに対する感受性を高める;代謝経路の改変を介して細胞老化を誘導することで、癌細胞の増殖を阻害する。

 CRISPR KO実験とsiRNA KD実験と共に、TCGAデータセットからも、卵巣癌を含む数種類の癌細胞でTIGARが増幅しており、またTIGARの高発現と悪性卵巣癌患者の全生存期間の短さが相関することも見出し、TIGARを標的とする癌療法の裏付けを得た。

 以上、研究チームは、Warburg効果の調節に関わるTIGARを標的とする療法を併用することで、相同組み換えが障害されていない癌細胞に対してもPARP阻害剤オラパリブが奏功する可能性を示した。

[出典] "Essentiality of CREBBP in EP300 truncated B-cell lymphoma revealed by genome-wide CRISPR-Cas9 screen" Nie M, Du L, Zhang B [..] Zhang F, Pan-Hammarström Q. bioRxiv. 2019-08-28

背景
  • びまん性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL)は、遺伝子発現パターンをもとに2000年にAlizadehらによって(Nature 2000) 胚中心B細胞型 (Germinal center B-cell (GCB) type)と活性型B細胞型 (Activated B-cell-like (ABC) type)に大別された。
  • ABC型の予後が平均してGCB型に比べて不良とされたが、療法への応答性からABC型とGCB型がさらにサブタイプに分類されることも示唆された。その後、2018年に至り米国NCIを始めとする研究グループから遺伝子サブタイプが発表された (NHEJ 2018)。 
  • 遺伝子サブタイプは、NIH NEWS RELEASE (2018-04-11) の図にあるように、必ずしも遺伝子発現で大別されたサブルグープがそれぞれ細分化するというよりは、両者は多対多の関係になった。
  • こうした極めて多様なDLBCLの治療には、遺伝子発現プロファイルと遺伝子変異プロファイルに基づいて患者を層別化し、それぞれに最適化する必要がある。
  • B細胞性リンパ腫に見られる遺伝子変異の中で、CREBBPなどのヒストンアセチル化酵素 (HAT)とそのパラログのEP300の機能喪失変異が最も高頻度である。これらの遺伝子の中で、siRNAスクリーン実験から、CREBBP不全肺癌細胞に対してEP300阻害が合成致死をもたらすことが示唆された (国立がん研究センタープレスリリース 2015-12-09)。
成果
 Karolinska Institutet, Broad Institute, BGI-Shenzhenなどの研究グループは今回、ゲノムならびにトランスクリプトームの偏りの無い時系列解析に基づいて、特定のDLBCL細胞株や患者亜集団に特有な治療標的 (DLBCLが依存する遺伝子)を同定可能なことを示した。
  • GCB型DLBCL患者由来細胞株RC-K8を対象とする全ゲノムシーケンシング (WGS)とRNA-seq、加えて、偏りの無いゲノムワイドCRISPR-Cas9機能喪失スクリーン (28日におよぶ時間変化測定)を行なった。また、これまでに公表された癌細胞一般およびDLBCL細胞株のCRISPR-Cas9スクリーンの結果も再評価した。
  • WGSからは、均衡転座の発生により、EP300のC末端が欠失し、RNA-seqからアセチル化を担うブロモドメインとHATドメインを欠損した短縮型タンパク質が生成されることが示唆された。
  • CRISPRスクリーンからは早期 (7日目)に、RC-K8細胞株におけるCREBBPMDM2への依存性を含む遺伝子の必須性が見え、徐々に、酸化的リン酸化関連遺伝子への依存性が増すことが見えた。コピー数が多い遺伝子はCRISPRスクリーンでは「遅れて」必須性が見えてくると考えられる。
  • 各種解析を総合して、EP300欠損細胞のCREBBPへの特異的依存性を含むRC-K8細胞に特有な遺伝的必須性パターンを見出した。また、CREBBPに変異、転座またはコピー数減少がみられるDLBCL細胞株全般EP300が必須であることも見出した。
  • CREBBPそしてまたはEP300を欠失している細胞に残っているHAT機能の依存性が新たな治療標的であると見られたが、ブロモドメイン阻害剤CBP30は奏功せず、HATドメイン阻害剤のA-485が奏功し、HATドメインがCREBBP欠損またはEP300欠損細胞株に必須であることが示唆された。
B細胞リンパ腫を標的とするCRISPR-Cas9スクリーン (crisp_bio記事)

1. CRISPR-Cas9によるノックアウト実験からSCAF4とSCAF8によるmRNA抗転写終結の分子機序を同定
[出典] "SCAF4 and SCAF8, mRNA Anti-Terminator Proteins" Gregersen LH [..] Svejstrup JQ. Cell 2019-05-16.
  • タンパク質コーディング遺伝子には複数のポリアデニル化部位が存在し代替ポリアデニル化が発生する。The Francis Crick Institute, The Netherlands Cancer InstituteならびにUniversity of Oxfordの研究グループは今回、SCAF4とSCAF8それぞれのシングルノックアウト)およびダブルノックアウトに、ドキシサイクリンによって誘導可能なSCAF4またはSCAF8をレスキューするコンストラクトを組み合わせた実験により、SCAF4とSCAF8が協働して早期のポリアデニル化を乗り越えて、短縮型タンパク質の生成ひいては細胞死を防止することを同定した。
2. その欠損が、KRASG12C阻害剤の効力を高める一連の遺伝子群を同定し、“collateral dependencies” (CDs) の概念を提唱
[出典] "KRASG12C inhibition produces a driver-limited state revealing collateral dependencies" Lou K [..] Shokat KM, Gilbert LA. Sci Signal. 2019-05-28.
  • GTPアーゼの一種であるKRAS遺伝子の変異が多くの癌をドライブし、その遺伝子産物のタンパク質はアンドラッガブルと言われていた。
  • 2013年にG12C変異を帯びたKRASを阻害する低分子が同定された (*)。この低分子は、GDP結合型のKRASG12Cに特異的に存在するアロステリックスイッチIIポケット (S-IIP)に結合することで、KRASを、この不活性化型に止め、GTPが結合した活性型への遷移を阻害する(*1)。
  • UCSFの研究グループは今回その中で化合物ARS-1620 (*2)に注目し、KRASG12Cを帯びた肺癌と膵臓癌の細胞モデルにおいて、ゲノムスケールCRISPRiを利用して、活性型の維持に必須な遺伝子群 (その欠損がKRASG12C細胞のARS-1620に対する感受性を高める遺伝子群)を同定し、これらの遺伝子群を 、合成致死 "synthetic lethal" (SL)とは異なる“collateral dependencies (CDs)”の概念で捉えることを提唱した。
 * 参考文献
  1.  "K-RasG12C inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions" Ostrem JM [..] Shokat KM. Nature 2013-11-20.
  2. "Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor" Janes MR [..] Liu Y. Cell 2018-01-25.
3. 全エクソームのトリオ解析による遺伝子心疾患の病因遺伝子変異の同定と、CRISPR-Cas9で作出したモデルマウスでの検証
[出典] "Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier" Gifford CA [..] Srivastava D. Science 2019-05-31.
  • Gladstone Institute of Cardiovascular DiseaseとUCSFの研究グループは、無症候性の両親と若年性心疾患を発症した子3名の全エクソームシーケンシング解析から、病因候補とみされるMKL2MYH7、およびNKX2-5遺伝子のミスセンス変異を同定した。前2者の変異は心臓発生に関与する転写因子遺伝子であり、無症候の父親由来、NKX2-5は心筋構造タンパク質をコードする遺伝子でありその変異は母親由来であった。
  • 研究グループはCRISPR-Cas9を利用して3種類の変異を帯びたマウスを作出し、複合ヘテロ接合性変異を介して、子らに見られるような心疾患を発症することを確認し、家族由来のhPSC細胞から分化させた心筋細胞を対象とする実験で3種類の遺伝子変異と心疾患との関連を裏付けた。

1. ヒト卵割胚は、BEによる安定したホモ接合型ヌクレオチド置換を可能にする
[出典] "Human cleaving embryos enable robust homozygotic nucleotide substitutions by base editors" Zhang M, Zhou C, Wei Y, Xu C [..] Mitalipov S, Chen Z, Yang H. Genome Biol 2019-05-22.
  • 上海生命科学研究院などの中国研究グループは、BE3とABEを二細胞期および四細胞期の卵割胚に注入することで、MII期の卵母細胞または受精卵への注入の13倍に至るホモ接合型ヌクレオチド置換効率を達成した。マウス胚で報告されたBE3によるオフターゲット変異は、見られなかった (原論文Fig. 1引用下図参照)。Cleaving embryo
2. 癌細胞に見られるスプライシング因子変異と合成致死の関係にある因子を、線虫モデルで同定
[出典] "SF3B1 cancer-related mutations cause vulnerability to further perturbations in the U2 snRNP complex in C. elegans (旧タイトル Modeling of SF3B1 cancer-related missense mutations in C. elegans uncovers targets for synthetic lethal interactions) Serrat X [..] Cerón J. bioRxiv 2019-05-15.
  • SF3B1は癌細胞で高頻度に変異しているスプライシング因子であるが、SF3B1の変異は癌細胞の増殖亢進をもたらすとともに、癌細胞に治療標的となる脆弱性をもたらす可能性がある。スペインのModeling human disease in C. elegans Groupなどスペインとフランスの研究グループは今回、他のモデル動物と異なり、ホモ型SF3B1変異を維持することが可能な線虫において、合成致死スクリーンを行なった。CRISPR/Cas9により変異体と蛍光レポータを作出し、RNAiスクリーンによって、U2 snRNPsftb-1/SF3B1変異と合成致死の関係にあることを同定した。
  • SF3B1関連crisp_bio記事:CRISPRメモ_2019/05/06 [第5項目] CRISPR-Cas9による植物の指向性進化 (directed evolution)を実現 (RNAスプライシング必須遺伝子SF3B1を標的とするCRISPR-Cas9)
3. 標的遺伝子のプロキシーを利用して、CRISPR技術により変異誘発されたシロイヌナズ同定を効率化
[出典] "Proxies of CRISPR-Cas9 activity to aid in the identification of mutagenized Arabidopsis plants" Li R, Vavrik C, Danna CH. bioRxiv 2019-05-14.
  • CRISPR-Cas9ゲノム編集技術の出現によって植物の機能ゲノミクスが大きく進展したが、ゲノム編集が起こった植物を選別する過程の効率化が課題として残っている。 University of Virginiaの研究チームは今回、いずれかの遺伝子座の編集が他の遺伝子座の編集のプロキシーになり得るという前提のもとに、'CRISPR co-editing selection' (以下、CCS)の戦略を実装し、CRISPR変異誘発が起きたシロイヌナズナ同定の効率化を実現した。
  • CCSは、機能解析の対象である遺伝子(gene(s) of interest: GOI)と同時にプロキシーを編集する。プロキシーには、その機能喪失がもたらす表現型が、容易に検出可能であり、かつ、GOIの機能喪失から予想される表現型とは明確に異なる内在遺伝子を選択する。研究チームは、機能が互いに直交する3種類のプロキシー (JAR1; GL1; EIN2)のCCSを行い、いずれのプロキシーについても他のプロキシーに起こる変異を40~100%予測可能なことを見出した。したがって、プロキシーによるスクリーン対象の絞り込みは、CRISPRスクリーンの効率化に貢献することになる。
4. CRISPR技術による細胞特異的な時計遺伝子破壊実験は、ショウジョウバエの時計ニューロン群が分散ネットワークを構成して概日行動を調節することを示唆
[出典] "Dissection of central clock function in Drosophila through cell-specific CRISPR-mediated clock gene disruption" Delventhal R, Pantalia M [..] Shirasu-Hiza M. bioRxiv 2019-05-17.
  • ショウジョウバエでは分子時計タンパク質を発現する~150種類の時計ニューロンが、概日行動を調節し、そのうち神経ペプチドPdfを分泌する時計ニューロン16種類が、概日リズムに必須とされて、"マスターペースメーカ"と呼ばれている。
  • Columbia University Medical Centerの研究グループは今回、Cal4-UASシステムを利用した細胞特異的CRISPR-Cas9遺伝子編集により、時計ニューロンの機能を分析した。その結果、朝時計 (morning oscillator)と夜時計 (evening oscillator)の双方において分子時計タンパク質をノックアウトすると概日行動活性が失われるが、朝時計または夜時計のどちらか一方の分子時計が活きていれば、概日行動が維持されることを見出した。すなわち、どちらかが一方を制御する階層性が見られなかった。
5. 常在および病原性酵母Malassezia furfurの遺伝子機能同定を、アグロバクテリウムを介したT-DNA挿入変異誘発ならびにCRISPR/Cas9遺伝子編集により実現
[出典] "Advancing functional genetics through Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis and CRISPR/Cas9 in the commensal and pathogenic yeast Malassezia furfur" Ianiri G, Dagotto G, Heitman J (Duke University Medical Center). bioRixv 2019-05-15.

[出典] "Genetic Screens Reveal FEN1 and APEX2 as BRCA2 Synthetic Lethal Targets" Mengwasser KE, Adeyemi RO, Leng Y, Choi MY, Clairmont C, D'Andrea AD, Elledge SJ. Mol Cell. 2019-01-24.

背景
  • 二本鎖DNA切断 (DSB)の修復過程には相同組み換え(HR)、非相同末端結合 (NHEJ)およびマイクロホモロジー媒介末端結合 (Microhomology-mediated end joining, MMEJ)の3種類が存在する。この修復過程に関与する遺伝子は、癌細胞では高頻度で変異している。
  • HR修復過程に必須なBRCA1またはBRCA2の変異は、遺伝性の乳癌と卵巣癌の主因であり、いずれかの変異を帯びた女性には80%の乳癌リスクと50%の卵巣癌リスクがあり、高悪性度卵巣癌 (high-grade serous ovarian cancers, HGSOC)患者の~50%にはHR遺伝子変異が見られその30%はBRCA1/2の変異である。なお、BRCA2の変異は膵臓と前立腺の癌の病因にもなり得る。
  • BRCA1/2遺伝子が機能不全を起こした細胞は、ポリ (ADP-リボース)ポリメラーゼ (PARP)阻害剤により合成致死に至るが、BRCA1/2遺伝子が正常な細胞はPARPを阻害してもDNA損傷応答が維持される。
  • PARP阻害剤がBRCA1/2不全細胞に対して合成致死を誘導する作用機序として、当初、PARP1/2のDNA一本鎖損傷 (SSB)修復機能を阻害する機序が想定されていたが、近年、PARP阻害剤がPAR1/2をSSB部位に物理的に固定し複製フォークの進行を阻害する機序 (PARP trapping)がSSBs集積よりも細胞毒性が強いことが明らかにされた (Murai et al, 2012)。
  • 米国FDAはすでにいくつかのPARP阻害剤を抗癌剤として承認したが、一方で、PARP阻害剤に対してBRCA1/2不全の細胞が内因性の耐性を帯びていることや耐性を獲得することが明らかになってきた。
成果
  • Harvard Medical SchoolとBrigham and Women’s Hospitalの研究グループは今回、BRCA2の野生型細胞と変異型細胞をペアとしたsnRNAとCRISPR-Cas9に基づくスクリーンにより、DNA損傷応答に関与する遺伝子群からBRCA2変異に合成致死をもたらす阻害剤の標的遺伝子 (BRCA2 synthetic lethal genes, B2SLs)を同定した。
  • その結果、BRCA2変異細胞は、塩基除去修復 (BER)、ATR活性化、およびスプライシングを含む多重なパスウエイに依存することを見出し、B2SL遺伝子として、APEX2FEN1を同定した。
  • BRCA2変異細胞は、BERに関与するAP endonucelase/脱プリン部位エンドヌクレアーゼApe2 (APEX2)を必要とし、BERを担うと見られてきたApe1 (APEX1)は必須遺伝子ではなかった。また、APEX1の過剰発現がAPEX2欠損を相補するに至らず、APEX2をB2SL遺伝子と結論するに至った;Ape2はApe1と異なりPCNAに結合して複製フォークに関与し、PCNA結合部位を欠損したApe2は、BRCA2変異細胞に合成致死をもたらす。
  • スクリーンからフラップエンドヌクレアーゼFEN1がB2SL遺伝子であることを同定し、FNE1の化学的阻害がBRCA2変異細胞を選択的に細胞死に誘導することを確認し、FEN1がスクリーンから同定したB2SL遺伝子の中で最も強力なB2SL遺伝子であるとした (BRCA2変異細胞は、FEN1の5'末端の突出DNAを切断するフラップエンドヌクレアーゼ活性を必要とし、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は必要としなかった)。
  • 研究グループは、マイクロホモロジー媒介末端結合 (Microhomology-mediated end joining, MMEJ)レポータを開発し、FEN1がBERとともにMMEJにも関与し、相同組み換え修復 (HR)が不全の場合にNHEJよりもMMEJが修復過程として重要なことも明らかにした。
  • スプライシング因子のSF3B2SF1を含むいくつかのB2SL遺伝子がshRNAスクリーンでは同定され(CRISPRスクリーンではヒットせず)、SF3B2の阻害がBRCA2変異細胞を細胞死へ誘導することを確認した。
  • 今回新たに同定したB2SL遺伝子は、BRCA変異乳癌、再発性HGSOCおよびPARP阻害剤耐性BRCA変異腫瘍の有力な治療標的であり、その阻害剤は、PARP阻害剤の併用剤あるいはPARP阻害療法後ろの療法として有望である。
  • B2SLs同定の他に研究グループは、すべてのRad1パラログおよびPalb2およびBrca2自身の欠損が、卵巣癌と結腸癌由来のBRCA2のエクソン11を欠損した(Rad51結合部位に相当)変異細胞の増殖を亢進することも見出し、ある種のHR阻害剤が癌を悪化させる可能性を示唆した。

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