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[出典] CF-PA2Vtech: a cell-free human protein array technology for antibody validation against human proteins. Morishita R [..] Sawasaki T. Sci Rep. 2019-12-18.

 抗体は、ペプチド、タンパク質および化合物といった特定の分子の検出に広く使われているが、標的分子に対する特異性には課題を残しており、抗体を使った実験データの信頼性を高める努力が続いている [1-3]。セルフリーサイエンス社と愛媛大学プロテオサイエンスセンターの研究グループは今回、抗体の品質を効率よく同定可能とする技術、CF-PA2Vtech、を開発し、その性能を抗HA抗体と抗PD-L1抗体の交叉反応性の同定で実証した。
  • 研究グループは、ヒト全長cDNAsのN末端にFLAG-GST (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)を融合し、コムギ胚芽無細胞 (Cell Free: CF)タンパク質合成技術 (生化学, 2007)に基づいて19,712種類のヒト組換えタンパク質を合成した上で、10~14種類のタンパク質を混合し、グルタチオンを表面に結合させた磁気ビーズと強力なマウネットプレートを介して、384ウエル x 12枚または1,536ウエル x1枚のプレートのウエルに固定したタンパク質アレイ (Protein Array: PA) を構築していた[Figure 1の一部引用下図A/B/C参照]Figure 1  part
  • 研究グループは今回、このPAに基づいて抗体 (Antibody: A)の特性評価 (Validation: V)する技術 (technology)を確立し、CF-PA2Vtech、として発表した
  • 市販の抗-HA抗体 (TANA2, MBL)または抗-PD-1抗体(D4W2J, Cell Signaling Technology) をモデルとして実証実験を行い、PAからそれぞれ、13種類と3種類のヒトタンパク質と結合することを見出し [抗-HA抗体についてTable 1引用下図参照]、この交叉反応性を免疫ブロット法で裏付けた。Table 1
  • CF-PA2Vtechでは全てのタンパク質が全長cDNAに紐付けられていることから、設計されたエピトープの配列との相同性検索から交叉反応したタンパク質のエピトープ候補配列を推定し、続いて、アラニンスキャニングにより、それらがエピープであることを裏付けた。
  • 抗-PD-1抗体(D4W2J)の場合、エピトープは残基Ala274を囲むペプチド (•••GPRSAQPLR•••) とされているが、Figure 4/Table 2引用の下図にあるように、PD-1であるClone-4の他のClone-1, -2および-3のエピトープ候補は、SAQそしてまたはRxAQの配列を帯びていた。研究グループは、アラニンスキャニングの結果も受けて、抗-PD-1抗体(D4W2J)は、主としてRxAQ配列をエピトープとして認識するとした。Fig. 4- Tab 1
「抗体の品質」関連crisp_bio記事
crisp_bioブログのカテゴリ「PDIS事業成果」の意味:PDISは創薬等支援技術基盤プラットフォーム事業の略称であったが、この事業終了後のAMEDにおける後継プロジェクトに由来する成果も「PDIS事業成果」にカテゴライズ。

[出典] "Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories" Liu Y, Mi Y, Mueller T, Kreibich S [..] Aebersold R. Nat Biotechnol. 2019-02-18

背景
  • 抗体や培養細胞など生体材料の標準化は長年の課題である (文末の'関連crisp_bio記事'参照)。代表的なヒト培養細胞であるHeLa細胞はこれまでに10万件を超える論文で直接利用されるか参照されてきたが、HeLa細胞はゲノムが不安定であり、継代あるいは研究室間の交換を経てゲノム変異を蓄積することが知られている。
  • 現在、HeLa細胞株の中で、'オリジナル'のHeLa CCL2、HeLa S3 (HeLa CCL 2.2)、および、HeLa Kyotoが広く使われている。HeLa CCL2(*)とHeLa Kyoto (**)のゲノムは2013年に解読され、両者の間で配列、コピー数および染色体が異なることが明らかにされ、また、HeLa KyotoにおけるmRNA発現が研究室間で異なることも報告されてきたが、ゲノムの不均一性がプロテオームや細胞表現型に与える影響や、継代培養にともなう不均一化については、ほとんど、明らかにされてこなかった。
成果
  • スイス、ドイツ、イタリア、米国、中国の国際共同研究グループは今回、13研究室からの14種類のHeLa細胞株を共通の条件で培養し、コピー数、mRNAs、タンパク質およびタンパク質代謝回転を分析し、HeLa細胞株間に著しい不均一性が存在することを見出した。特に、CCL2とKyoto株の間の差異が最も顕著であった。 細胞株間の多様性に加えて、特定の細胞株について50回継代培養において徐々に形質が多様化することも見出した。
  • 遺伝的多様化は複雑であり、トランスクリプトーム、プロテオーム、およびタンパク質代謝回転プロファイルに、非線形的な影響を与える。
  • 63種類のタンパク質に基づくHeLa細胞株のプロテオタイプと、サルモネラ菌に対する応答が相関する。
  • ヒト培養細胞を利用した実験結果の生物学的解釈をするにあたって、細胞自身に内在する多様性がもたらす影響を評価する必要がある。
関連crisp_bio記事など
  • 2018-08-13 癌細胞株の遺伝変異も薬剤耐性も、研究室内・間で、不均一化する
  • 2018-06-04 HeLaの亡霊:流通している培養細胞株におけるコンタミネーションと変異の問題
  • 2017-04-29 抗体は、最も広く使われている試薬の一つであるが、最も頭痛の種になる試薬の一つでもある
  • (*) "The haplotype-resolved genome and epigenome of the aneuploid HeLa cancer cell line" Adey A [..] Shendure J. Nature. 2013-08-07.
  • (**) ”The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line” Landry J [..] Steinmetz LM. G3 (Bethesda). 2013-03-11;NEWS "Most popular human cell in science gets sequenced - The HeLa cell genome is riddled with errors, raising questions about its continued use" Callaway E. Nature. 2013-03-15.
  • Nature Biotechnology からのツイート (2019-02-19)

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/10/06)
  • Corresponding author: Seth Blackshaw (Johns Hopkins University)
  • 市販の抗体の品質に関心が高まっていた中で、NIHは2010年にCommon Fundの一環として、ヒト転写因子(hTFs)と転写共役因子に対する親和性標識試薬(affinity reagents)を作出・配布するProtein Capture Reagents Program(PCRP)を開始し、650種類以上のhTFsとその関連タンパク質をカバーする1,500以上の試薬がデータとともに、提供するに至った。
  • PCRPパイプライン
    • Rutgers U.におけるhTFsの構造ドメインとそれを補完する全長hTFsを抗原とし、モノクローナル抗体を産学共同(Johns Hopkins U.とCDI)で、ファージディスプレイ法による組換え抗体をRecombinant Antibody Network (RAN)で作成。
    • 3段階のスクリーン
      • mAbは、ヒトプロテオームマイクロアレイHuProtでスクリーン、rAbは、ELISAによってKd < 50 nMをスクリーン
      • 免疫沈降法(IP)とウエスタンブロッディング(WB)で評価。
      • 第三者機関(National Cancer Institute)で安定性、再現性などの評価。
  • 関連サイト

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2015/12/03)
[注] 本記事のタイトルはNature 11月26日号の記事"Antibody anarchy: a call to order"に掲載されていた写真のキャプションの一部を訳したものです. 
[これまで]
  • 1994年から2011年までJournal of Comparative Neurology (JCN) の編集長を務めていたClifford Saperは、抗体を使った論文の評価をする術が無い事に気づき、 2006年に、投稿者に実験に使用した抗体に関する詳細な検証データを要求する"one-journal revoltion"を起こした.その結果、JCNへの投稿を回避する研究者が増えたが、JCN Antibody Database (7520抗体を収録(2014年 V14))が結実している.
  • 2006年以後の論文1万編で使われていた抗体を分析したところ、ポリクローナル抗体1,293種類、モノクローナル抗体755種類、そして、組換体抗体1種類という結果であった.そのなかでいまだに、ラベルにあるタンパク質と異なるタンパク質に結合する、新しいロットを使い始めたら過去の実験結果を再現できなくなった、といった嘆きが尽きない.
  • Biocompare社によると研究用抗体のマーケットは25億ドル/年で年々増加している、一方で、抗体問題が実験研究にもたらした損失は少なくとも年間8億ドルに及ぶと見られている.抗体問題は、抗体の特性が不正確なことだけが原因ではなく、販売名が異なるにもかかわらず同一製造元に同一製品である場合があることも一因.
[これから]

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/09/10)
  • Corresponding author: Mathias Uhlén (KTH Royal Institute of Technology)
  • 抗体を使った実験データの品質と一貫性に欠ける問題(*)を解決することを目的とした抗体バリデーションのガイドラインが、ad hoc International Working Group for Antibody Validation (IWGAV)(**)から発表された。 
    (*) 参考記事:創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2015/12/03 抗体は、最も広く使われている試薬の一つであるが、最も頭痛の種になる試薬の一つでもある。 
    (**) IWGAVは、The Human Protein Atlasを率いているMathias Uhlénが主導して立ち上げた委員会である。
  • 抗体を使ったアッセイでは、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ELISAなどのアプリケーション***によってサンプルの処理方法が異なるため、アプリケーションを意識した上で、バリデーション手法の5つの柱(pillar)を提唱。また、同一タンパク質であっても細胞や組織によって抗体の反応が異なる(コンテクスト依存)ことにも注意を喚起:*** 以下の括弧内はアプリケーションの略号:WB, western blot; IHC, immunohistochemistry; ICC, immunocytochemistry, including immunofluorescence microscopy; FS, flow sorting and analysis of cells; SA, sandwich assays, including ELISA; IP, immunoprecipitation; ChIP, chromatin immunoprecipitation; and RP, reverse-phase protein arrays.
    1. CRISPR技術による遺伝子ノックアウトまたはRNAiによる遺伝子ノックダウン(WB, IHC, ICC, FS, SA, IP/ ChIP, RP)
    2. 質量分析のように抗体を使用しない手法との組み合わせ(WB, IHC, ICC, FS, SA, RP)
    3. 同一の標的に対して互いに独立な(エピトープを共有しない)複数の抗体を使用(WB, IHC, ICC, FS, SA, IP/ ChIP, RP)
    4. アフィニティータグで標識したタンパク質の発現測定(WB, IHC, ICC, FS)
    5. 免疫捕獲と質量分析との組み合わせ(IP/ChIP)
    6. 5本の柱の少なくとも1つの柱を実施することが必須であり、さらに、複数の柱を組み合わせることが望ましい。
  • 論文上で、実験に使用された抗体を特定する仕組みも標準化し、利用者と提供者に普及することが必要。例えば、カタログ番号とロット番号に加えてResource Identification InitiativeのResearch Resource Identifiers (RRIDs)の利用(https://scicrunch.org/resources/)そしてあるいは抗体の配列。
  • 抗体の提供者へ:5つの柱の少なくとも一つの柱に属するバリデーションを、できる限り多くの細胞種で実施し、その実験条件の詳細を開示する。バリデーションはロットごとに実施する。抗体にはカタログ番号とロット番号にさらにRRIDsを付与する。 
    [情報拠点注] バリデーションを促進する提供者も出始めている。
  • 抗体由来のデータの品質向上に向けて、学術雑誌ならびにNIHなどの研究資金提供機関は実験研究に使用した抗体の特定に必要な情報と実験条件を明らかにすることを求めていく。

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