タグ:塩基編集(BE)

[出典] Base Editing Promise in Treating a Mouse Model of Progeria. Davies K. GEN Genetic Engineering & Biotechnology News. 2020-02-14.

 2020年2月8-13日にカナダのバンフで開催された“Engineering the Genome” Keystone Symposium [*]でのDavid Liuの口頭発表を、Kevin Davies  がレポート

 ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群 (HGPS) の患者のほとんどが、ヒト1番染色体に位置し細胞核の完全性に関与するラミンA遺伝子 (LMNA) の第11エクソンにc.1824C>Tの変異を帯びている (Nature, 2003 [1])。このHGPS変異がプロジェリン (progerin)と呼ばれる短縮形ラミンAタンパク質をもたらし、プロジェリンが細胞内に蓄積して早老症を引き起こすとされている。

 ヒトLMNA変異修復については、この変異を導入したトランスジェニックHGPSモデルマウスにおいて、SpCas9とSaCas9によってラミンAとプロジェリンの双方の発現を抑制することで、症状が改善され、寿命な伸びることが、Salk研究所のグループと、スペインと英国の共同研究チームにより報告されていた [crisp_bio 2018-05-30: 2]。

 Liuグループは今回、ABEmax [crisp_bio 2018-05-30: 3]を利用して、LMNA変異修復を試みた。
  • はじめに、HGPS患者由来の線維芽細胞において、ABEmaxを介して変異を90%まで修復可能なことを確認した。プロジェリンのRNAとタンパク質のレべルが顕著に低下し、細胞核が正常な形を取り戻した。CIRCLE-seq [CRISPRメモ_2018/10/22: 4]での検証では、オフターゲット編集は非検出であった。
  • 次に、ABEmaxを二分割することでHGPSモデルマウスへのAAV9によるデリバリを実現した上で、用量やデリバリ時期を変えて実験を繰り返し、出産後2週間が最適時期であることを同定した (なお、ヒトHGPSは生後生後6か月〜24か月間に好発する、とされている)。
  • ABEmaxによって、大動脈を含む多重な組織でプロジェリンのRNAとタンパク質のレベルがいずれも低下し、また、正常なLMNAの発現が上昇することを確認した。大腸脈は、組織学的にも、正常に復した。
  • マウス個体としても、ABEmaxを投与しなかったマウス (7.5月齢)は早老症の症状を呈し、ABEmaxを投与したマウス (8月齢)は溌剌としていた (注: 口頭発表でビデオで紹介された)。
  • ABEmaxデリバリによる寿命も延び、出産後数日でデリバリした場合は平均して78%延びた。出産後2週間でABEmaxをデリバリしたマウスの寿命は不明である (発表時点ではまだまだ元気にしていたので)。
[引用文献とcrisp_bio記事]
  1. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Eriksson M [..] Collins FS. Nature 2002-04-25
  2. 2019-02-24 早老症のCRISPR-SpCas9またはSaCas9による遺伝子治療 (細胞モデルとマウスモデルにて)
  3. 2018-05-30 [第1項] 塩基エディターBE4とABEを、BE4max/AncBE4max/ABEmaxへと強化
  4. CRISPRメモ_2018/10/22 [第1項] [プロトコル] CIRCLE-seqによりCRISPR-Cas9のヌクレアーゼの活性をゲノムワイドで決定する
 [注*] Keystone Symposiaからの“take-home message”を前Editas Medicine CTOのVic Myerがツイート: 


[出典] Next-generation cytosine base editors with minimized unguided DNA and RNA off-target events and high on-target activity. Yu Y [..]  Ciaramella G, Gaudelli NM. bioRxiv 2020-02-12; PRESS RELEASE Beam Therapeutics Announces Closing of Initial Public Offering. Beam Therapeutics 2020-02-11 7:41 AM EST

 David Liu, Keith JoungならびにFeng Zhangを共同設立者とするBeam Therapeuticsは、2月11に締め切ったのIPOで~2億米ドルを調達したところ、2月12日に、オンターゲット塩基変換の高い活性と、オフターゲットの塩基置換活性 (spurious-deamination)の抑制を両立した次世代CBEsを、bioRxivに投稿した。

 実用CBE (Cytosine base editors)の'始祖'である rAPOBEC1を組み込んだBE3 [1]は、高用量にて頻度は低いが、本来のDNAのオフターゲット・サイトにおけるC-to-T変換と、標的細胞内のRNAにC-to-U変換を誘導することが、マウス胚やイネの細胞内で発生すること、また、マウス胚にてSNVsが誘導されること、が報告されてきた [2-5]。これらのオフターゲット現象はCas9非依存であり、シトシン・デアミナーゼ (脱アミノ酵素)とssDNAとの結合親和性に由来することが示唆されていた。

 研究グループは今回、ssDNAの脱アミノ化を高感度かつハイスループットで判定可能な細胞アッセイ法を開発した上で、153種類のシチジン・デアミナーゼをそれぞれ組み込んだCBEs (BE4 [6]; ABE7.10 [7]についても)を評価し、オン/オフ活性の比からみて最も有望なCBEsとして4種類)を同定した [注: 研究グループは当初、デアミナーゼ・ドメインへの変異導入を検討したが、BE4の性能向上に寄与する変異導入を見いだせなかった]。

 さらに、デアミナーゼ・ドメインの構造情報に基づいて変異を導入することで、8種類の次世代CBEsに至った:  BE4-PpAPOBEC1, BE4-PpAPOBEC1 (H122A), BE4-PpAPOBEC1 (R33A), BE4-RrA3F, BE4-RrA3F (F130L), BE4-AmAPOBEC1, BE4-SsAPOBEC3B ならびに BE4-SsAPOBEC3B (R54Q)

 次世代CBEsの活性をrABPOBEC1を組み込んだBE4と比較すると、DNAオンターゲットサイトでの活性は同等であり、DNAオフターゲットサイトでのC-to-T変換が33分の1まで、RNAにおけるC-to-U変換が10~49分の1にまで抑制された。

 [引用crisp_bio記事]
  1. CRISPR関連文献メモ_2016/04/21 [第2項] DNA二本鎖切断を介さずに、ゲノムDNA中の1塩基を編集
  2. 2019-03-02 C-to-T塩基編集(BE3)は、イネでもマウスでも、大規模なオフターゲット変異を伴う
  3. 2019-04-19 塩基編集ツールCBE (rAPOBEC1)とABEは、DNAを編集する間に、RNAも編集する
  4. 2018-11-28 BE3とCas9がオフターゲットとオンターゲットに誘導する変異プロファイル2報
  5. 2018-11-16 D. R. Liuによる塩基編集技術 (BE)のレビューと最新論文
  6. 2017-09-05 塩基編集法(BE)第4世代へ:BE1, BE2, BE3からBE4へ
  7. 2019-06-12 BE3とABE7.10によるRNAオフターゲットSNVs大量発生とその抑制法

[出典] Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs. Miller SM, Wang T [..] Liu DR. Nat Biotechnol 2020-02-10

 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)とその変異体が標的可能な範囲 (scope)は、Gを含むPAM配列に大きく制約されてきた。David R. Liuらは今回、その制約を取り払うSpCas9変異体を開発した。
  • Liuグループは、2011年に開発 (Nature, 2011)したファージを介した持続的指向性進化法PACE (phage-assisted continuous evolution) [1-2]を利用して、Cas9やCBEのPAMの制約緩和と高精度化を進めて来た。 (PACEのNature論文の第一著者が公開しているWebページの図を以下に引用)PACE
  • 今回は、PACEの新たなセレクション戦略3種類と、一定容量の培養器内に遺伝子回路を組み込んだ大腸菌を流し込みながら目的とする変異を帯びたタンパク質をコードするファージを連続して選択していくPACEを、プレートを移し替えていく非連続的な手法へ改変したPANCE (phage-assisted non-continuous evolution)を介して、NRRH, NRCHおよびNRTHの配列をPAMとして認識する3種類のSpCas9変異体 (SpCas9-NRRH, SpCas9-NRTHならびにSpCas9-NRCH)を作出するに至った [ここで、Nは任意の塩基、RはGまたはA、HはA, CまたはT、を意味する]。
  • これら3種類の新たなSpCas9変異体が揃ったことで、NRNHをPAM配列とする領域の編集が可能になった。
  • SpCas9新変異体に加えて先行研究のSpCas9-NG [3] (NGをPAMとして認識)の活性を、全てのNNNN PAMsにわたるプロトスペーサとsgRNAのペアを導入したHEK2943T細胞にて、検証した。
  • SpCas9新変異体はHEK293T細胞とヒト初代線維芽細胞で活性を示し、従来のCas9野生型または変異型では標的不可能であった領域へのindels誘導と塩基変換 (CBEとABE)を実現した。
  • 例えば、Gを含まないCACC PAMを認識するSpCas9新変異体を組み込んだABE (A:T-to-G:C)によって、これまで不可能であった鎌状赤血球症の病因変異を、病原性が無いとされている変異 'Makassar β-globin variant (HbG)'に変換することに成功した。
 SpCas9新変異体と先行研究からのSpCas9-NGおよびxCas9 [4]によって、ほとんどのNとR (AまたはG)からなるPAM配列を伴う領域が標的可能になり、ひいては、標的不可能なゲノム領域を大幅に縮小することになった。

[注] S.M.M., T.W.およびD.R.L.は本研究に関連して特許申請; Liuグループは本論文と同時に、CBEの高精度化の論文も発表: crisp_bio 2020-02-12 LiuグループによるCBE (C:G-to-T:A)の高精度化

 [関連crisp_bio記事]
  1. 2019-07-24 一塩基編集 (CBE)、ファージに依存する持続的進化法 (PACE)により、進化続く
  2. CRISPRメモ_2018/11/19-2 [第9項] [FORUM]ファージを介した持続的定向進化(PACE)を利用したC•G→G•C塩基編集法開発を解説
  3. 2018-08-31 SpCas9-NG:SpCas9の標的範囲をさらに広げる合理的な変異導入
  4. 2019-10-14 xCas9のPAM拡張と高精度の構造基盤 (2)2018-03-02 xCas9:PAMの拡張とオフターゲット抑制を両立

[出典] Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editorsDoman JL, Raguram A, Newby GA, Liu DR. Nat Biotechnol 2020-02-10

 Base Editors (BEs)に続いてPrime Editors (PEs) [1: crisp_bio 2019-10-22]を開発してきたDavid R. Liuの研究グループは今回、BE3 (オリジナルのCBE)がマウス胚でもイネでもゲノムワイドでオフターゲットのサイトにC:G-to-T:A変換を誘導する[2: crisp_bio 2019-03-02参照]という報告に応えた。
  • BE3はrAPOBEC1–dSpCas9 (A840H)–UGIの構成が、SpCas9-sgRNAで位置決めして、シチジンデアミナーゼで塩基対置換を誘導する。SpCas9を利用することから、BE3は、プロトスペーサ上でNGG PAMから遠い領域における5-ntのウインドウ内 (PAMの座標を21-23とすると、座標~4-8)のCをTへと変換する。
  • BE3はSpCas9を利用することから、SpCas9のオフターゲット・サイトにBE3が結合し活性を示す可能性があり、これまで、 野生型SpCas9を高精度版SpCas9を利用するか、または、タンパク質-RNA複合体として活性を維持的にすることで、オフターゲット・サイトでの塩基置換を抑制することが試みられてきた。
  • このCas9依存オフターゲット変換のリスクに加えて、BE3はCas9に依存しないオフターゲット変換も誘導する。2019年にマウス胚とイネにおいてBE3を過剰発現させると、BE3のデアミナーゼ・ドメインがゲノムワイドでDNAにランダムに結合し、それぞれ、5 × 10−8per bpと5.3 × 10−7per bpの頻度で変換を誘導することが報告された [2: crisp_bio 2019-03-02参照]。
  • このCas9非依存オフターゲット変換の検査には経費も時間もかかる全ゲノムシーケンシングが必要であったことから、研究グループは始めに、Cas9非依存オフターゲット変換を、E. coliまたはヒト細胞株をプラットフォームとして判定するシステムを開発し、このシステムを利用してCas9非依存オフターゲット変換を最小限にしつつオンターゲット変換の効率を損なわないCBE変異型を開発した。
  • 塩基交換によりE. coliが2種類の抗生物質に対する耐性獲得を見ることで、オンターゲット活性と、Cas9非依存オフターゲット活性を判定可能とした。このシステムを利用して、BE3を含むこれまで報告されてきた全てのCBEのデアミナーゼ (POBEC1, AID, CDA, APOBEC3A, APOBEC3BならびにAPOBEC3G)とデアミナーゼ変異体 [*]を評価した。
  • HEK293T細胞におけるdSaCas9が誘導するR-ループと外来ssDNAを対象とするアッセイ系、精製したCBEタンパク質のin vitroでの運動速度論的アッセイ系を確立・利用し、また、それらのアッセイ系の結果を、HEK293T細胞の全ゲノムシーケンシング解析で検証することも行った。
  • さらに、SpCas9をSpCas9-NG [3: crisp_bio 2018-08-31参照]とSpCas9-CP1028 [4: crisp_bio 2019-05-22参照]に置換し、BE4のフォーマット[5: crisp_bio 2017-09-05]で評価した。
結論
  • オフターゲットを最小限にするCBEsは今回評価した範囲内ではYE1-BE4, YE2-BE4, YEE-BE4, EE-BE4, R33A + K34A-BE4, YE1-BE4-CP1028, YE1-BE4-NGならびにR33A + K34A + H122L + D124N-BE4であり、中でもYE1-BE4を推奨する。
  • これらは一連のCBEsは、BE4maxに対して、Cas9非依存オフターゲット変換を~10-100分の1に、Cas9依存オフターゲット変換を~5-20分の1に抑制し、indels発生を同等または抑制し、その一方で、オンターゲット変換活性の~50-90%を維持する。
  • Nature Biotechnologyから本論文と同時に発表されたnon-G PAMまでPAMを拡張したSpCas9の新たな変異体の論文に、その変異体がCBEに有効であったことも報告されている: "Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs" Miller SM, Wang T [..] Liu DR. Nat Biotechnol 2020-02-10
 [*] 対象としたデアミナーゼ変異体
  • Liuらのオンターゲット変換のウインドウ幅を狭めたAPOBEC1変異体 (W90Y + R126E (YE1), W90Y + R132E (YE2), R126E + R132E (EE), ならびにW90Y + R126E + R132E (YEE))とRNA結合モチーフを欠損させた小型のFERNT
  • Joungらのオフターゲット変換を低減した変異体APOBEC1変異体R33AとR33A + K34A、ならびに5'Tを必須としたAPOBEC3A (eA3A)
[注] J.L.D., A.R.および D.R.L.は本研究に関連する特許を申請; Liuグループは本論文と同時に、グアニンを含まない配列をPAMとして認識するSpCas9変異体開発の論文を発表: crisp_bio 2020-02-13 Liuグループ、グアニンを含まない配列をPAMとするSpCas9変異体をファージによる指向性進化法で実現

 [関連crisp_bio記事]
  1. 2019-10-22 David R. Liuグループからプライムなゲノム編集法 - BEsに続くPEs
  2. 2019-03-02 C-to-T塩基編集(BE3)は、イネでもマウスでも、大規模なオフターゲット変異を伴う
  3. 2018-08-31 SpCas9-NG:SpCas9の標的範囲をさらに広げる合理的な変異導入
  4. 2019-05-22 Cas9改変によりCBEmax/ABEmaxの標的可能領域拡大 (それぞれClinVar病原性SNPsの~30%から~50%へ)
  5. 2017-09-05 塩基編集法(BE)第4世代へ:BE1, BE2, BE3からBE4へ
  6. 2020-02-10 BE3の高精度化 (3) - シチジンデアミナーゼへの変異導入を介して
  7. 2020-02-05 BE3の高精度化 (2) - 標的可能領域拡大と位置特異性付加
  8. 2019-01-31 BE3の高精度化 (1) - シチジンデミナーゼとCas9の間のリンカーの最適化

[出典] High-fidelity base editor with no detectable genome-wide off-target effects. Zuo E, Sun Y, Yuan T, He B, Zhou C [..] Li Y, Yang H. bioRxiv 2020-02-09

概要
  • CBEとABEは病因変異の修復ツールとして期待されているが、CBEは特に、標的としたDNAとRNAの双方にオフターゲット編集 (一塩基変異/SNVs)を誘導することが報告され、その抑制法が工夫されてきている。
  • 中国農業科学院深セン農業ゲノム研究所、中国科学院上海生物科学研究所、上海科技大学などの研究グループは今回、シチジンデアミナーゼを改変することで、オフターゲット編集を検出限界を下回るまでに抑制可能なことを示した。
CBEのオフターゲット関連crisp_bio記事抜粋
  • 2020-02-05 BE3の高精度化 (2) - 標的可能領域拡大と位置特異性付加
  • 2019-01-31 BE3の高精度化 (1) - シチジンデミナーゼとCas9の間のリンカーの最適化
  • 2018-11-28 BE3とCas9がオフターゲットとオンターゲットに誘導する変異プロファイル2報 [第1項] 一塩基編集(BE3)はオフターゲットSNVsを顕著に誘発する  [GOTI法論文:今回と同じ研究グループの成果]
  • 2019-06-12 BE3とABE7.10によるRNAオフターゲットSNVs大量発生とその抑制法 [今回と同じ研究グループの成果]
  • 2019-11-27 塩基編集CBEによるヒトiPSCsの遺伝子編集には、ABPOBECが誘導するオフターゲット変異が伴う
  • 2019-04-20 [展望]オフターゲット・プロファイリングの進歩と塩基編集 (Base Editor: BE)のオフターゲット最小化
  • 2019-03-02 C-to-T塩基編集(BE3)は、イネでもマウスでも、大規模なオフターゲット変異を伴う
詳細
  • ラット・シチジンデアミナーゼ (rAPOBEC1)またはヒト・シチジンデアミナーゼ (hAPOBEC3A)のssDNAまたはRNA結合ドメインに変異を導入しテストした。変異を導入した24種類のシチジンデアミナーゼを組み込んだCBE、BE3またはBE3-hA3A、をHEK293T細胞でスクリーニングし、オンターゲット編集の効率が損なわれていないCBEsを7種類同定し、また、そのうち、4種類についてオンターゲットでのindel発生が増加しないことも同定した。
  • これら7種類に、オンターゲット編集効率が高いhA3A変異体1種類を先行研究 (crisp_bio 2019-06-12) から加えた8種類について、マウスの2細胞期胚の2つの割球の一方をコントロールとするオフターゲット判定法GOTIとRNA-seqを利用して、オフターゲットSNVs発生をゲノムワイドで判定した。
  • BE3R126Eは、DNA SNVs非検出を達成したが、RNA SNVsの抑制効果は僅かであった。
  • BE3-hA3AY130Fは、RNA SNVs非検出を達成したが、DNA SNVsの抑制効果を伴わなかった。
  • BE3R132E、BE3W90Y+R126E、ならびにBE3W90F+R126Eは、DNAとRNA双方についてSNVs非検出を達成した。なお、これら3種類はオンターゲットでのindels発生が増加しなかったrAPOBEC1が組み込まれている。
 本研究は、rAPOBEC1に然るべき変異を導入することで、BE3におけるSNVs発生が抑制され、また、dCas9-TET1やdCas9-VP64といったシステムのTET1やVP64の変異体を利用することでそれらのオフターゲット変異抑制が可能なことを示唆した。

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