タグ:核酸医薬

[出典] (NEWS) "Gene-silencing technology gets first drug approval after 20-year wait" Ledford H. Nature. 2018 Aug 10.;(NEWS)  FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease" FDA News Release 2018 Aug 10.
  • RNAiの発見(Nature 1998) から20年、2018年8月10日に、Alnylam社のsiRNA(small interfering ribonucleic acid)治療薬patisiran (Onpattro)が、希少疾患であるトランスサイレチン型家族性(hATTR)アミロイドーシスに起因する末梢神経疾患の治療薬として、FDAに認可された。FDAとして、hATTRによる多発性ニューロパチー治療薬として初であり、また、siRNA治療薬としても初の認可である。
  • Alylam社は2002年にpatisiranの開発に着手し、RNAi研究(A. Z. FireとCraig C. Mello)は、2006年ノーベル生理・医学賞を受賞したが、siRNA創薬の道は険しかった。
  • RNAの機能性を失わずに標的に送達することが、siRNA創薬において解決すべき課題であった。すなわち、血中でのRNAの分解を回避し、腎臓での濾過排出を回避し、そして、血中から標的器官に拡散させる手段の模索が続いた。2010年までに、大手製薬企業はRNAi創薬への関心を徐々に失い、2016年にAlnylam社がhATTRアミロイドーシスを標的とするsiRNA薬revusiranの臨床試験において、プラセボよりも死亡率が高かったことからrevusiranの開発を中止したことで、投資家も関心を失った。
  • 一方で、いくつかのRNAi技術関連企業はRNA送達手法の研究開発を継続していた。Alnylam社も脂質ナノ粒子内に収容することでRNAを保護する手法や、化学修飾によってRNAを保護する手法の研究開発を継続していた。これらの手法で血中に注入されたRNAが腎臓と肝臓に蓄積されることから、Alnylam社は主として肝臓で生産されるトランスサイレチンに注目した。脂質ナノ粒子でshRNAを送達するpatisiranが、神経障害を伴う遺伝性のトランスサイレチン型家族性(hATTR)アミロイドーシスを標的とする225人の臨床試験で、効果を示した。例えば、プラセボ投与集団では徐々に遅くなっていく歩行速度が、patisiran投与集団では歩行速度が回復することが示された。
  • 今後、patisiran (Onpattro)の適用範囲が広げられることを期待したい。また、肝臓以外の腎臓、眼、脳、脊髄を標的とするsiRNA創薬あるいは、嚢胞性線維症を標的とするsiRNA創薬が、Quark PharmaceuticalsあるいはArrowhead Pharmaceuticalsで進められていることにも注目したい。
  • 関連記事 (2018-09-09追記) "[TRADE SECRESTS]Alnylam launches era of RNAi drugs." Nat Biotechnol 2018 Aug 21 20:01 BST.

1.Xanthomonas albilineans タイプI-F CRISPR-CasシステムのCsy1-Csy2ヘテロ二量体とcrRNAおよび抗-CRISPRタンパク質 AcrF2との相互作用
  • [出典] Hong S, Ka D, Yoon SJ, Suh N, Jeong M, Suh JY, Bae E. "CRISPR RNA and anti-CRISPR protein binding to the Xanthomonas albilineans Csy1-Csy2 heterodimer in the type I-F CRISPR-Cas system" J Biol Chem. 2018 Jan 18.
  • X. albilineansのタイプI-F CRISPR-Casシステムには4種類のCasタンパク質(Cys1-4)が、crRNAとサーベイランス複合体を形成する。ソウル大学、順天郷大学校、信州大学の研究チームは今回、Csy1とCsy2のサブ複合体、crRNAとの相互作用、 およびPseudomonas aeruginosaに感染するファージ由来のAcrF2との相互作用を生化学的に解析し、AcrF2の結晶構造解析も行なった(PDB ID 5YHR (1.34 Å分解能))。
  • AcrF2は、単独のCsy1あるいはCsy2と安定な複合体を形成しないが、ヘテロ二量体とは安定な複合体を形成して、I-F CRISPR-Casシステムを不活性化する。
2.デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)治療用エクソンスキッピング核酸医薬の評価に有用な細胞モデル作出
  • [出典] Shimo T, Hosoki K, Nakatsuji Y, Yokota T, Obika S. "A novel human muscle cell model of Duchenne muscular dystrophy created by CRISPR/Cas9 and evaluation of antisense-mediated exon skipping" J Hum Genet. 2018 Jan 16.
  • 米国FDAは2016年にデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)治療薬として初となるアンチセンス核酸医薬eteplirsenを承認した。Eteplirsen はスプライス-スイッチング-オリゴヌクレオチド(SSO)でありDMD遺伝子のエクソン51のスキップによる効用を示す。
  • 大阪大学とアルバータ大学の研究チームは今回、マイナーなDMD病因欠損に対して効果的なSSOの探索も可能とするプラットフォームとして、CRISPR/Cas9によって、ヒト横紋筋肉種細胞株においてDMD遺伝子のエクソン51〜57(〜0.3 Mb)を除去した細胞モデルを開発した。
  • このプラットフォームにより既報のSSOsのエクソン50スキッピング活性を、mRNAとタンパク質レベルで評価可能なことを示した。
  • 本手法は、他の変異にも展開可能である。
3.脂質カプセルに収めた金ナノ粒子からのCRISPR-Cas9システム放出をレーザ照射で調節する癌療法
  • [出典] Wang P, Zhang L, Zheng W, Cong L, Guo Z, Xie Y, Wang L, Tang R, Feng Q, Hamada Y, Gonda K, Hu Z, Wu X, Jiang X. ”Thermo-triggered Release of CRISPR-Cas9 System by Lipid-Encapsulated Gold Nanoparticles for Tumor Therapy” Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Dec 28.
  • CRISPR-Cas9システムの送達効率向上を目指した中国のNational Center for NanoScience and Technologyや東北大学などの研究チームの成果
  • 膜融合TATペプチドで修飾した金ナノ粒子に、ヒト・メラノーマの治療標的遺伝子であるポロ様キナーゼ(Plk-1)を標的とするCas9システム(Cas9-sgPlk-1)のプラスミド(CP)を静電相互作用で凝縮させ(AuNPs/CP: ACP)し、脂質(DOTAP、DOPE、コレステロールそしてPEG2000-DSPE)での被覆(LACP)を、適切な重量比を選択することで、実現(LACPには、AuNPsが4-15個内包される)。
  • LACPは腫瘍細胞に侵入し、レーザー照射により金ナノ粒子が熱源となることで温度上昇によりCP(Cas9-sgPlk-1)を細胞質内へ放出、CPはTATペプチドにより細胞核へ移動し細胞核内でTATからCas9-sgPlk-1が遊離し、Plk-1を破壊。
  • ヒトメラノーマ細胞株A375とマウスメラノーマモデルにおいて、LCAPおよびLACPとレーザー照射によるPlk-1タンパク質と腫瘍量の低減を確認。A375細胞では、LACPの動態も観察。
4.[特許] 複数sgRNAを単一ベクターで送達し、3~50種類の変異を帯びた癌モデルを作出する技術に関する特許
  • [出典] DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION FO MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO. UA2018/0010134 A1. PubDate 01/11/2018.
  • Inventors: Sharp, Phillip A; Zhang, Feng; Platt, Randall Jeffrey; Chen, Sidi
  • Assignee: Broad Inst; MIT

5.[特許] PAMの選択など酵母ゲノム編集用CRISPR-Casシステムに関する特許
  • [出典] A CRISPR-CAS SYSTEM FOR A YEAST HOST CELL. UA 2018/0010151 A1. PubDate: 01/11/2018
  • Inventor: Verwaal R, Meijrink B,  Wiessenhaan N,  Vonk B,  Roubos JA (Echt, NL) 
  • Assignee: DSM IP ASSETS B.V. (Heerlen, NL) 

6.初代ヒトT細胞において、KEAP1をCRISPR/Cas9で欠損させることでNRF2を活性化
  • [出典] Noel S, Lee SA, Sadasivam M, Hamad ARA, HRabb. "KEAP1 Editing Using CRISPR/Cas9 for Therapeutic NRF2 Activation in Primary Human T Lymphocytes" J Immunol. 2018 Jan 19.
  • 急性腎不全モデルにおいて、KEAP1欠損が酸化ストレス耐性を高めることが知られていた。JHUの研究チームは今回、ヒトT細胞(Jurkat)において、KEAP1の第2エクソンを標的とするCas9-sgRNAによって70%の効率でKEAP1を欠損させることで、NRF2転写因子の標的遺伝子(NADPH脱水素酵素キノン1(NQQ1);ヘム酸素添加酵素1(HOP1);グルタミン酸システインリガーゼ(GCLM))の発現が亢進することを見出した。
  • 初代T細胞では編集効率は〜40%であったが、Jurkat細胞株と同様に、NQQ1HOP1GCLMの発現がそれぞれ16倍、9倍および2倍になった。また、KEAP1欠損細胞集団においてCD69陽性とIL-10陽性の細胞が増加した。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/09/11)
  • Corresponding authors: 谷口陽祐;佐々木 茂貴(九州大学)
  • 2本鎖鎖DNAに配列特異的にもう一本のDNA(3本鎖DNA形成オリゴヌクレオチド/triplex-forming oligonucleotide (TFO))と2本鎖DNAの間にG-GC、A-ATおよびT-ATのホモプリン-ホモピリミジン結合が形成されることで反平行3本鎖DNAが配列特異的に形成される。しかし、GCとATそれぞれにおいて塩基対が入れ替わったCGとTAを認識する天然のヌクレオシドは存在せず、3本鎖DNA形成には至らない。
  • 研究チームは今回、CG塩基対を選択的に認識する擬デオキシシチジン(ΨdC)誘導体を設計・合成した。アミノピリジニル基を伴うΨdCは、その上流と下流の塩基のいかんにかかわらずGCに対して高い選択性と親和性を示した。
  • さらに、3メチル-2アミノピリジンΨdC(MeAP-ΨdC)が、HeLa細胞においてテロメラーゼTERT の4つの連続したCGを伴うプロモーターと3本鎖DNAを形成し、TERT の転写を阻害しmRNAの発現量を抑制することを見出した。
  • MeAP-ΨdCは、2本鎖DNAを標的とする人工核酸によって遺伝子発現を抑制可能とするアンチジーン核酸医薬開発への手がかりとして有望である。

(創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 20160416)
  • Corresponding authors: 野中洋介(リボミック);濡木 理(東京大学)
  • ATX(ENPP2)の発現亢進は、神経因性疼痛、乳がん、神経膠芽腫などの多様な疾患の病因とされ、また、最近、肺線維症の病因でもあることが明らかにされた。ATXは分泌型リゾホスホリパーゼD (lysophospholipase D, LysoPLD)であり、リゾホスファチジルコリン(lysophosphatidylcholine, LPC)を加水分解してリゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid、LPA)を産生する。肺線維症は、LPAがLPA受容体の一種LPA1を活性化し線維芽細胞を遊走させるとことによって発症する。
  • ATX-LPA1軸を標的として第Ⅱ相試験まで進んでいる低分子化合物は存在し、ATX阻害抗体の研究開発も行われているが研究チームは今回、in vitro においてもin vivo においてもAXNを特異的かつ強力に阻害する核酸医薬抗ATX DBAアプタマーを開発した。
  • SELEX法で選別した候補からATX阻害に最小限必要なDNAアプタマーのステム領域を特定し、体内のヌクレアーゼから保護する修飾を加えたDNAアプタマー候補の中で、ヒトとマウスのATXに対して生理条件下で特異性と親和性が高かったRB011についてATXとの複合体構造の解析へと進み、RB011とATX結合の構造基盤を明らかにし、それに基づいて、RB011の構造を改変し、RB011より強力にLysoPLD活性を阻害するRB012とRB013を作出した(IC50 1.8nMと0.85nM)。また、マウスモデルにおいてATXを効果的に阻害するRB012からの誘導体RB014を得た。
36680001
  • ATXが多様なシグナル伝達に関与することからATX阻害剤にはオフターゲット作用の問題が存在する。DNAアプタマーを鼻腔内あるいは気管内投与した場合血漿中のDNAアプタマーは検出限界(0.56μg)未満であったことから、DNAアプタマーは肺線維症治療に適用可能である。

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